王 剛 楊 濤 彭克楠 郭留雄 孫福振 谷守義 劉俊江

(河北省人民醫(yī)院泌尿外科，河北 石家莊 050051)

膀胱癌具有發(fā)病率高、致死率強(qiáng)等特點(diǎn)，且易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)〔1，2〕。如何減少腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲是目前延長腫瘤患者生存期的重要途徑〔3〕。Twist是一種高度保守的轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)上調(diào)是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的重要原因，也是腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的重要誘導(dǎo)因子〔4〕。Twist在肺癌、口腔癌等腫瘤中高表達(dá)，研究顯示，Twist表達(dá)下調(diào)后可以降低胃癌、結(jié)腸癌等癌細(xì)胞的侵襲能力〔5～8〕。本研究旨在探討Twist對膀胱癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響。

1 材料與方法

1.1材料 膀胱癌5637、T24、BIU-87細(xì)胞和正常膀胱SVHUC-1細(xì)胞購自中科院細(xì)胞庫，5637、T24、BIU-87細(xì)胞培養(yǎng)于10%胎牛血清的RPMI1640中，SVHUC-1細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的Ham′F12K中，細(xì)胞均放在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。Prime Script RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premis Ex Taq PCR試劑盒購自大連Takara；RNA提取試劑盒購自北京BioTeke；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗購自美國ImmunoReagents Inc；波形蛋白(Vimentin)一抗、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9一抗購自美國santacruze；上皮鈣黏附素(E-cadherin)一抗、MMP-2一抗購自美國Abcam；Lipofectamine2000購自美國Thermo。

1.2qRT-PCR測定Twist表達(dá) 收集膀胱癌5637、T24、BIU-87細(xì)胞和正常膀胱SVHUC-1細(xì)胞，用RNA試劑盒提取細(xì)胞總RNA，同時(shí)檢測各細(xì)胞RNA樣品A260/A280的比值(1.8～2.0)。用Prime Script RT反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，用SYBR Premis Ex Taq進(jìn)行qRT-PCR，GAPDH為內(nèi)參，分析Twist mRNA表達(dá)。引物：GAPDH上游5′-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3′，下游5′-TGAAGGGGTCATTGATGGCA-3′。Twist上游5′-GGAGTCCGCAGTCTTACGAG-3′，下游5′-TCTGGAGGACCTGGTAGAGG-3′。引物均由上海英俊生物公司合成。

1.3Western印跡測定Twist表達(dá) 收集膀胱癌5637、T24、BIU-87細(xì)胞和正常膀胱SVHUC-1細(xì)胞，分別用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞2次，添加裂解液，在冰上孵育20 min，期間震蕩3次。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到離心管中，4℃離心10 min。吸取上清，保存于-80℃。用二喹啉甲酸(BCA)法測定濃度。取蛋白樣品，加入到等體積的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝脈電泳(SDS-PAGE)上樣緩沖液中，在沸水中煮5 min。變性后的蛋白保存在-80℃。變性蛋白樣品按照每個(gè)泳道40 μg添加，先用80 V電泳大約0.5 h以后，此時(shí)溴酚藍(lán)達(dá)到分離膠，再把電壓調(diào)大至120 V，2 h后，取出凝膠，在4℃，200 mA進(jìn)行電轉(zhuǎn)。用5%脫脂奶粉封閉1.5 h以后，再與1∶600稀釋的Twist一抗在保鮮膜密封的蠟板上4℃過夜。再與1∶2 000稀釋HRP標(biāo)記的二抗放在室溫下孵育2 h。電化學(xué)發(fā)光(ECL)，用Image J對各條帶進(jìn)行灰度分析，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算Twist灰度值÷GAPDH灰度值，比值作為Twist蛋白水平。

1.4細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染 T24細(xì)胞分為3組，T24細(xì)胞用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染shRNA Twist后記為sh-Twist組，轉(zhuǎn)染shRNA control后記為sh-NC組，以不做任何處理的T24細(xì)胞記為Con組。細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟參照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說明書，shRNA Twist、shRNA control由上海吉瑪合成。各組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后分別培養(yǎng)24 h，參照上述qRT-PCR和Western印跡法分別測定各組細(xì)胞中的Twist mRNA和蛋白水平。

1.5Transwell小室測定各組細(xì)胞遷移和侵襲能力 細(xì)胞侵襲和遷移能力測定均用Transwell小室進(jìn)行檢測，侵襲實(shí)驗(yàn)前用基質(zhì)膠將Transwell濕化(用不含血清的培養(yǎng)液將基質(zhì)膠以1∶3稀釋，在小室中添加40 μl，放在37℃孵育2 h)，遷移實(shí)驗(yàn)不用基質(zhì)膠濕化，其他步驟相同，簡述如下：Transwell小室放在24孔的培養(yǎng)板中，在實(shí)驗(yàn)開始前分別用不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液將各組膀胱癌細(xì)胞調(diào)整為每毫升含有106個(gè)細(xì)胞，每組添加100 μl的細(xì)胞懸浮液于小室的上室中，同時(shí)在下室內(nèi)加入600 μl的常規(guī)培養(yǎng)液。24 h后，將各組小室取出以后，用4%的多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染10 min。用PBS洗滌以后，在顯微鏡下分別選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)穿膜的細(xì)胞數(shù)目。

1.6Western印跡測定Vimentin、E-cadherin、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá) 各組細(xì)胞按照1.5中方法處理培養(yǎng)24 h以后，提取各組細(xì)胞中的總蛋白，用Western印跡方法測定細(xì)胞中Vimentin、E-cadherin、MMP-2、MMP-9蛋白水平?？贵w稀釋分別為：Vimentin(1∶600)、E-cadherin(1∶600)、MMP-2(1∶800)、MMP-9(1∶800)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1Twist在各細(xì)胞中表達(dá)比較 膀胱癌5637、T24、BIU-87細(xì)胞中Twist mRNA和Twist 蛋白水平均明顯高于正常膀胱細(xì)胞SVHUC-1(P<0.05)，并且T24細(xì)胞中Twist mRNA和Twist 蛋白水平明顯高于5637、BIU-87細(xì)胞(P<0.05)。見圖1和表1。Twist在膀胱癌細(xì)胞中過度表達(dá)，后續(xù)選用表達(dá)水平最高的T24做后續(xù)試驗(yàn)。

2.2shRNA Twist下調(diào)膀胱癌細(xì)胞中Twist的表達(dá) sh-Twist組Twist mRNA和蛋白水平均明顯低于Con組(P<0.05)，sh-NC組Twist mRNA和蛋白水平與Con組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2和表2。shRNA Twist下調(diào)膀胱癌細(xì)胞中Twist的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄。

2.3各組細(xì)胞侵襲和遷移能力比較 sh-Twist組遷移細(xì)胞數(shù)目、侵襲細(xì)胞數(shù)目和MMP-2、MMP-9蛋白水平均明顯低于Con組(P<0.05)，sh-NC組遷移細(xì)胞數(shù)目、侵襲細(xì)胞數(shù)目和MMP-2、MMP-9蛋白水平與sh-Twist組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3和表2。shRNA Twist能夠降低膀胱癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力，減少基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9的表達(dá)。

表1 Twist在膀胱癌5637、T24、BIU-87細(xì)胞和正常膀胱SVHUC-1細(xì)胞中的表達(dá)水平

與SVHUC-1相比：1)P<0.05；與T24相比：2)P<0.05

圖1 Western印跡測定Twist在膀胱癌5637、T24、BIU-87細(xì)胞和正常膀胱SVHUC-1細(xì)胞中的表達(dá)

圖2 Western印跡測定轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞中Twist蛋白表達(dá)

表2 各組Twist mRNA及蛋白、遷移細(xì)胞數(shù)目、侵襲細(xì)胞數(shù)目及MMP-2、MMP-9、Vimentin、E-cadherin蛋白水平比較

與Con相比：1)P<0.05

圖3 Western印跡測定各組細(xì)胞中MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)

2.4各組Vimentin及E-cadherin表達(dá)比較 sh-Twist組Vimentin蛋白水平明顯低于Con組，E-cadherin水平明顯高于Con組(P<0.05)，sh-NK組Vimentin、E-cadherin蛋白水平與Con組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖4和表2。shRNA Twist能夠抑制膀胱癌細(xì)胞EMT。

圖4 Western印跡測定各組細(xì)胞中Vimentin、E-cadherin蛋白表達(dá)

3 討 論

Twist是一種最早發(fā)現(xiàn)于果蠅中的轉(zhuǎn)錄因子，其編碼的蛋白質(zhì)能夠與DNA結(jié)合，含有1個(gè)內(nèi)含子和2個(gè)外顯子，Twist與腫瘤有關(guān)，參與腫瘤細(xì)胞EMT，能夠促使腫瘤細(xì)胞形成新的轉(zhuǎn)移灶〔9〕。研究證實(shí)，Twist可以誘導(dǎo)黑素細(xì)胞轉(zhuǎn)化為黑色素瘤，并且與前列腺癌患者的預(yù)后有關(guān)，鼻咽癌中發(fā)現(xiàn)Twist在腫瘤侵襲中具有重要作用〔10～12〕。研究表明，Twist在膀胱癌中表達(dá)上調(diào)，并且與膀胱癌細(xì)胞的生長、凋亡等有關(guān)，其表達(dá)下調(diào)后可以發(fā)揮抗腫瘤作用〔13，14〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明Twist在膀胱癌細(xì)胞中表達(dá)異常升高，這與上述實(shí)驗(yàn)報(bào)道〔9～14〕相一致。

腫瘤轉(zhuǎn)移需要突破組織屏障，避免被免疫細(xì)胞清除，最終達(dá)到新的組織或者器官形成新的病灶，腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制較為復(fù)雜，細(xì)胞黏附能力、血管生成、細(xì)胞外基質(zhì)降解等都與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)〔15〕。Twist作為一種癌基因參與細(xì)胞的EMT過程，在細(xì)胞EMT發(fā)生時(shí)，細(xì)胞之間的黏附能力下調(diào)，E-cadherin表達(dá)水平降低，上皮細(xì)胞特性逐漸消失，細(xì)胞逐漸表現(xiàn)出間質(zhì)細(xì)胞特性，細(xì)胞的這一系列變化能夠促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，誘導(dǎo)細(xì)胞遷移和侵襲〔16〕。E-cadherin能夠抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移，其表達(dá)下調(diào)是腫瘤侵襲能力增加的重要標(biāo)志，Vimentin是間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白，其在腫瘤中表達(dá)上調(diào)〔17〕。研究顯示，Twist表達(dá)上調(diào)后可以促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞中Vimentin的表達(dá)，降低E-cadherin蛋白水平，誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞發(fā)生EMT〔18〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Twist敲低后的膀胱癌細(xì)胞中Vimentin水平降低，E-cadherin水平升高，細(xì)胞EMT水平下降，這與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似，說明Twist敲低可以阻礙膀胱癌細(xì)胞EMT。

腫瘤轉(zhuǎn)移與腫瘤細(xì)胞突破組織屏障有關(guān)，腫瘤細(xì)胞可以分泌大量的蛋白酶，而這些蛋白酶可以降解細(xì)胞外基質(zhì)，為腫瘤的轉(zhuǎn)移提供有利條件〔19〕。MMPs幾乎可以降解所有的細(xì)胞外基質(zhì)，是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要蛋白酶，MMP-2、MMP-9是MMPs家族中目前研究的與腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系最為密切的兩個(gè)成員，其可以降解細(xì)胞外基質(zhì)中的Ⅳ型膠原酶促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移〔20〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示Twist敲低可以通過下調(diào)MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)降低膀胱癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。

Twist是一種癌基因，參與腫瘤的轉(zhuǎn)移，在膀胱癌細(xì)胞中高表達(dá)，下調(diào)其表達(dá)后可以抑制膀胱癌細(xì)胞EMT，降低膀胱癌細(xì)胞侵襲和遷移能力，減少細(xì)胞表達(dá)MMPs，其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

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