王 璇 王 辰 秦麗微 秦麗紅

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江 佳木斯 154002)

中國(guó)腦梗死繼發(fā)癲癇發(fā)生率約為15.6%〔1〕。腦內(nèi)興奮性和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)失衡是癲癇發(fā)病的機(jī)制之一，其中γ-氨基丁酸、強(qiáng)啡肽、谷氨酸等神經(jīng)遞質(zhì)及受體發(fā)揮關(guān)鍵作用〔2〕。γ-氨基丁酸B受體基因亞單位(G1465A)和前強(qiáng)啡肽原啟動(dòng)子區(qū)基因多態(tài)性與顳葉癲癇相關(guān)〔3〕，但具體調(diào)控機(jī)制及腦梗死繼發(fā)癲癇易感基因方面的研究仍鮮有報(bào)道。本研究探討腦梗死繼發(fā)癲癇患者γ-氨基丁酸B受體基因(G1465A)和前強(qiáng)啡肽原啟動(dòng)子區(qū)基因多態(tài)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年10月至2016年10月佳木斯大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的腦梗死繼發(fā)癲癇患者52例(繼發(fā)癲癇組)，腦梗死無(wú)癲癇患者81例(無(wú)癲癇組)；診斷標(biāo)準(zhǔn)均符合急性缺血性腦卒中診治指南(2014版)，并簽署知情同意書(shū)。繼發(fā)癲癇組中男28例，女24例，年齡58～85歲，平均(70.61±8.37)歲，近1個(gè)月內(nèi)均未服用抗癲癇藥物，既往無(wú)癲癇史和其他顱內(nèi)疾病。無(wú)癲癇組中男45例，女36例，年齡56～87歲，平均(69.35±10.08)歲。選取同期90例體檢正常老年人為健康對(duì)照組，其中男49例，女41例，年齡60～85歲，平均(70.28±8.39)歲。三組受試者性別、年齡差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取 取三組受試者空腹肘靜脈血3 ml，放入抗凝劑預(yù)處理的試管中，使用全血基因組DNA小量提取試劑盒(上海索寶生物科技有限公司)，柱層析法提取基因組DNA，-20℃保存待測(cè)。

1.2.2γ-氨基丁酸B受體基因(G1465A)基因型檢測(cè) 采用PCR-RFLP技術(shù)檢測(cè)：①PCR反應(yīng)：上游引物5'-GAACGAT TGCACCCAAACTGG-3',下游引物5'-CTCGTGGCATGAGGTCCGA CC-3'；反應(yīng)體系30 μl(基因組DNA 0.1～0.2 μl,上游和下游引物各2 μl，2×TaqDNA聚合酶15 μl,雙蒸餾水適量)；常規(guī)反應(yīng)條件下進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，與末次循環(huán)結(jié)束后72℃延伸5 min；取產(chǎn)物10 μl,20瓊脂糖凝膠電泳，確定擴(kuò)增成功。②RFLP檢測(cè)：取PCR產(chǎn)物10 μl,雙蒸餾水17 μl,Tango緩沖液(10×)2 μl,EagⅠ1 μl,37℃反應(yīng)20 h，收集產(chǎn)物5 μl，瓊脂糖凝膠電泳，ChemiDoc MP成像系統(tǒng)中觀察擴(kuò)增情況。③結(jié)果判定：γ-氨基丁酸B受體基因第7外顯子1465位有G-A多態(tài)性，當(dāng)此位為G等位基因時(shí)，則有EagⅠ酶切位點(diǎn)；當(dāng)此位為A等位基因時(shí)，則無(wú)酶切位點(diǎn)。因此，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為1個(gè)片段(441 bp)為A/A型，3個(gè)片段(441 bp、183 bp、258 bp)為A/G型，2個(gè)片段(183 bp、258 bp)為G/G型。

1.2.3前強(qiáng)啡肽原啟動(dòng)子區(qū)基因多態(tài)性檢測(cè) 采用PCR技術(shù)檢測(cè)：①PCR反應(yīng)：上游引物5'-TCGTTAGTCT CCAACTTCAACCTGCG-3',下游引物5'- CGTGGTCCGCCAATCCA TCTCCAAGA-3'；反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同方法1.2.2。②PCR產(chǎn)物電泳和結(jié)果判定：取PCR產(chǎn)物10 μl，瓊脂糖凝膠電泳，ChemiDoc MP成像系統(tǒng)中觀察擴(kuò)增情況。產(chǎn)物片段長(zhǎng)度應(yīng)為：590 bp、522 bp、454 bp、386 bp，含有1～4個(gè)拷貝數(shù)的重復(fù)單位(68 bp)，電泳結(jié)果1個(gè)條帶的為純合子基因型，2個(gè)條帶的為雜合子基因型；等位基因含1～2個(gè)拷貝數(shù)的為L(zhǎng)型，含3～4個(gè)拷貝數(shù)的為H型。因此，前強(qiáng)啡肽原啟動(dòng)子區(qū)基因可分為：L/L型(1/1、1/2、2/2)；L/H型(1/3、2/3、1/4、2/4)；H/H型(3/3、3/4 、4/4)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0軟件行χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1γ-氨基丁酸B受體(G1465A)基因多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳顯示441bp條帶，見(jiàn)圖1。37℃經(jīng)EagⅠ酶切24 h后電泳僅顯示258 bp和183 bp條帶，見(jiàn)圖2。提示三組受試者γ-氨基丁酸B受體基因第7外顯子1465位均為G等位基因，基因型均為G/G型，無(wú)A/A型、A/G型。

1～3 繼發(fā)癲癇組，4～5 無(wú)癲癇組，6～7 健康對(duì)照組；圖2同圖1 γ-氨基丁酸B受體基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

圖2 γ-氨基丁酸B受體基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物EagⅠ酶切電泳圖

2.2前強(qiáng)啡肽原啟動(dòng)子區(qū)基因型分布情況 電泳顯示，前強(qiáng)啡肽原啟動(dòng)子區(qū)基因型分別為：L/L型(1/1、2/2)、L/H型(2/3、2/4)、H/H型(3/3)，見(jiàn)圖3。繼發(fā)癲癇組患者L/L型頻率明顯高于無(wú)癲癇組、健康對(duì)照組，H/H型頻率明顯低于無(wú)癲癇組、健康對(duì)照組(P<0.01)；無(wú)癲癇組與健康對(duì)照組前強(qiáng)啡肽原啟動(dòng)子區(qū)基因型分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

圖3 前強(qiáng)啡肽原啟動(dòng)子區(qū)基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

表1 三組前強(qiáng)啡肽原啟動(dòng)子區(qū)基因型分布比較〔n(%)〕

與繼發(fā)癲癇組相比：1)P<0.01

2.3前強(qiáng)啡肽原啟動(dòng)子區(qū)等位基因頻率分布情況 繼發(fā)癲癇組等位基因L型頻率為88.46%(46/52)，明顯高于無(wú)癲癇組、健康對(duì)照組的14.81%(12/81)、16.67%(15/90)；無(wú)癲癇組、健康對(duì)照組等位基因H型頻率為85.19%(69/81)、83.33%(75/90)，明顯高于繼發(fā)癲癇組的11.54%(6/52)(P<0.01)。無(wú)癲癇組與健康對(duì)照組前強(qiáng)啡肽原啟動(dòng)子區(qū)基因型頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，腦梗死后神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸可抑制興奮性氨基酸，減輕缺血造成的神經(jīng)細(xì)胞興奮毒性，而強(qiáng)啡肽原可抑制谷氨酸分泌，抑制神經(jīng)細(xì)胞興奮性，兩者均具有抗驚厥作用〔4〕。已發(fā)現(xiàn)的γ-氨基丁酸受體包括A、B、C三種亞型，其中A、B型受體與癲癇發(fā)生、發(fā)展有明顯關(guān)聯(lián)〔5〕。γ-氨基丁酸受體基因變異在癲癇發(fā)病機(jī)制中的作用受到廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，γ-氨基丁酸B受體基因(G1465A)多態(tài)性與顳葉癲癇有相關(guān)性〔6〕，但之后相關(guān)研究結(jié)論與其不完全一致〔7〕；且γ-氨基丁酸B受體基因多態(tài)性是否與繼發(fā)性癲癇發(fā)病相關(guān)尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究顯示，三組受試者γ-氨基丁酸受體基因均為G/G型，未發(fā)現(xiàn)A/A型、A/G型。其原因可能與人種差異有關(guān)，本次受試者均為漢族人群，而該人群中γ-氨基丁酸B受體基因第7外顯子1 465位很少存在G-A突變，并非腦梗死繼發(fā)癲癇的易感基因。強(qiáng)啡肽原為另一個(gè)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，與γ-氨基丁酸具有協(xié)同作用。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)啡肽原主要作用于Kappa類(lèi)阿片受體，且與NMDA受體結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)作用，抑制興奮性氨基酸誘發(fā)的驚厥〔8〕。前強(qiáng)啡肽是強(qiáng)啡肽原的前體，經(jīng)酶解可生成強(qiáng)啡肽原。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，人強(qiáng)啡肽原基因啟動(dòng)子區(qū)長(zhǎng)68 bp重復(fù)單元中含有AP-1結(jié)合位點(diǎn)，其中AP-1復(fù)合物H型等位基因活化后可提升強(qiáng)啡肽原基表達(dá)水平，而相同條件下L型等位基因無(wú)法活化〔7〕。本次研究提示前強(qiáng)啡肽啟動(dòng)子區(qū)基因型對(duì)腦梗死繼發(fā)癲癇有明顯影響，其中L型等位基因是繼發(fā)癲癇的易感基因，H型等位基因是保護(hù)基因。

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