董李學(xué)，袁萬(wàn)哲，左玉柱，王建昌，王金鳳

（1. 唐山市畜牧水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)中心，河北唐山 063000；2. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河北保定 071001；3. 河北出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，河北石家莊 050051）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）又稱(chēng)豬藍(lán)耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起豬的一種高度接觸性傳染病，主要引起懷孕母豬后期流產(chǎn)、早產(chǎn)，產(chǎn)死胎和木乃伊胎等繁殖障礙，仔豬出現(xiàn)呼吸道癥狀和斷奶前死亡率增高，同時(shí)還可引起免疫抑制、繼發(fā)感染及其他疾病免疫失敗等[1-2]。我國(guó)1996年首次報(bào)道該病[3]，2006年出現(xiàn)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（HP-PRRSV）[4]，2012年首次發(fā)現(xiàn)NADC30-like PRRSV[5-6]。PRRSV的不斷變異和擴(kuò)散，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。目前有關(guān)科研機(jī)構(gòu)已開(kāi)展了PRRSV監(jiān)測(cè)[7-8]、流行情況調(diào)查[9-10]以及基因變異分析[11]等工作。研究發(fā)現(xiàn)，NSP2蛋白作為PRRSV最大的非結(jié)構(gòu)蛋白，是PRRSV基因組中突變率最高的蛋白之一[12]。該蛋白不連續(xù)的30個(gè)氨基酸缺失，常作為HP-PRRSV鑒定的依據(jù)。PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白中變異最大的是ORF5 基因編碼的糖蛋白GP5。它是PRRSV 最主要的保護(hù)性抗原蛋白，常作為標(biāo)記性蛋白用于PRRSV流行病學(xué)監(jiān)測(cè)[13-14]。因此，通過(guò)對(duì)NSP2和ORF5基因的監(jiān)控，可以了解PRRSV的遺傳演化和變異規(guī)律。

本研究基于PRRSV NSP2和ORF5基因，2010—2016年在河北省開(kāi)展了PRRSV分子流行病學(xué)調(diào)查，并參考國(guó)內(nèi)外已發(fā)表的基因序列，繪制遺傳進(jìn)化樹(shù)，分析PRRSV遺傳變異趨勢(shì)，以豐富我國(guó)PRRSV的分子流行病學(xué)資料，進(jìn)而為PRRS防制提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品與毒株

2010—2016年在河北省10個(gè)地區(qū)18個(gè)發(fā)病豬場(chǎng)，采集新鮮豬肺臟、脾臟、肝臟和淋巴結(jié)等病料樣品。本研究所用毒株見(jiàn)表1。

表1 本研究中所用毒株的詳細(xì)信息

1.2 主要試劑

2×Taq PCR Master mix、MarkerⅢ：購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；Primer ScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit、pMDTM19-T vector、MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0：均購(gòu)自TAKARA公司；Top10感受態(tài)細(xì)胞：購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank已發(fā)表的HP-PRRSV變異毒株基因序列，分別設(shè)計(jì)1對(duì)包含缺失區(qū)段的NSP2基因上下游引物和完整E基因的上下游引物。引物分別由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成（表2）。

表2 NSP2和ORF5基因引物序列

1.4 病毒總RNA提取

將研磨好的組織病料離心，取上清液200 μL，按照MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit 操作說(shuō)明進(jìn)行核酸提取，最后用50 mL DEPC水溶解，于?20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 NSP2和ORF5基因RT-PCR擴(kuò)增

將提取的RNA進(jìn)行RT-PCR。反轉(zhuǎn)錄體系為：Random 6 mers（50 μmol/L）1.5 μL，dNTP Mixture（10 mmol/L）1 μL，RNA 5 μL，H2O 2.5 μL，65 ℃ 5 min，立即冰?。幌蝮w系中再加入5×primer ScriptⅡ Buffer 4 μL，PrimerScriptⅡ RTase 1 μL，RI 0.5 μL，H2O 4.5 μL，30 ℃ 10 min，70 ℃ 15 min。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋? 5℃ 5 min，95 ℃ 1 min，49～51 ℃ 30 s，72 ℃延伸 40 s，32 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.6 NSP2和ORF5基因克隆及序列分析

回收NSP2和ORF5基因目的片段并連接到pMDTM19-T載體，然后轉(zhuǎn)化至Top10感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行菌液PCR鑒定。將鑒定的陽(yáng)性菌液送上海生工測(cè)序。利用Lasergene軟件進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列分析，使用Mega軟件構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 NSP2和ORF5基因擴(kuò)增及克隆

經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，NSP2和ORF5基因擴(kuò)增片段大小與預(yù)期結(jié)果相符。分別將各回收目的片段克隆到pMDTM19-T中，對(duì)含重組質(zhì)粒的陽(yáng)性菌液分別測(cè)序。結(jié)果表明，擴(kuò)增得到的片段分別為PRRSV NSP2基因和ORF5基因（圖1、圖2）。

圖1 RT-PCR擴(kuò)增部分NSP2基因結(jié)果

圖2 RT-PCR擴(kuò)增ORF5基因結(jié)果

2.2 NSP2部分基因序列分析

經(jīng)序列測(cè)定，23株P(guān)RRSV的NSP2部分基因序列長(zhǎng)度為486 bp；與VR-2332、CH-1a相比，均在第481位和532～560位缺失30個(gè)氨基酸；氨基酸序列同源性為89.5%～98.8%，與參考毒株VR-2332、MLV的同源性為63.6%～67.9%，與JXA1氨基酸序列同源性為90.7%～98.8%。

2.3 ORF5基因序列分析

經(jīng)序列測(cè)定，最終獲得23個(gè)流行株的ORF5基因。基因總長(zhǎng)度為603 bp，編碼201個(gè)氨基酸；氨基酸間同源性為82.6%～99.5%，其中20個(gè)毒株（HB-SJZ、HB-SZJ1、HB-SJZ2、HB-BD1、HBBD2、HB-BD3、HB-HD1、HB-HD2、HB-QHD1、HB-TS、HB-TS1、HB-TS2、HB-CZ1、HBCZ2、HBHS1、HB-HS2、HB-CD1、HB-ZJK1、HBXL、HB-AG 與 SY0608、SX-1、Henan-1、JXA1）的氨基酸同源性為98.5%～99.0%，另3個(gè)（HB-HS、HB-CZ、HB-HD）與NADC30毒株的氨基酸同源性為91.5%～92%，而與MLV、VR-2332同源性?xún)H為 82.6%～88.6%。將23個(gè)毒株與國(guó)內(nèi)外已發(fā)表的PRRSV 相應(yīng)序列比較，并建立遺傳進(jìn)化樹(shù)（圖3）。結(jié)果表明：獲得的20個(gè)毒株與SY0608、SX-1、Henan-1、JXA1遺傳關(guān)系最近，與HB-1、HB-2關(guān)系較近，屬于同一個(gè)大分支，與MLV、VR-2332處于不同分支；而另3個(gè)毒株與NADC30毒株處于另一分支，遺傳關(guān)系較近。

圖3 ORF5 基因遺傳進(jìn)化樹(shù)

2.4 ORF5基因毒力和主要抗原表位變異分析

ORF5第151位氨基酸位于糖蛋白的疏水區(qū)。此氨基酸的變異改變了該區(qū)域的疏水性，從而可能改變病毒毒力。研究結(jié)果顯示，第13和151處的氨基酸突變與毒株毒力有關(guān)。與北美型標(biāo)準(zhǔn)株VR-2332相比，本試驗(yàn)獲得的23個(gè)毒株中，HB-HS、HB-HD、HB-CZ的第13位均發(fā)生變異（突變?yōu)镻或Q），其他未發(fā)生變化，均為R；HB-SJZ1、HB-HD、HB-CZ、HB-HS、HB-HS1、HB-HS2 的第151位已突變?yōu)橘?lài)氨酸（K）。這可能導(dǎo)致了該毒株毒力發(fā)生改變。而HB-HS、HB-HD、HB-CZ同時(shí)存在第13和151處的氨基酸突變。對(duì)ORF5基因的RT-PCR產(chǎn)物，用內(nèi)切酶MluⅠ進(jìn)行RFLP分析，以區(qū)分疫苗株和其他北美毒株。這是由于疫苗株第137位氨基酸為Ala，而其他野毒株的第137位均為Ser[15]。本試驗(yàn)獲得的23個(gè)ORF5氨基酸序列中的第137位氨基酸均為Ser，表明所獲得的23個(gè)毒株均可能為野毒株。

目前已確定的美洲株表位有3個(gè)：2個(gè)為非中和表位（27～30和180～197），1個(gè)為中和表位（37～45）。本試驗(yàn)獲得的23個(gè)ORF5氨基酸序列分析表明，在非中和表位29位點(diǎn)處，除HBBD3、HB-SJZ、HB-SJZ1、HB-HD、HB-CZ、HB-HS、HB-HS1、HB-HS2、HB-XL、HB-AG為Val外，其余均為Ala（與經(jīng)典株VR-2332和疫苗株MLV相同）；在180～197位點(diǎn)中，第185位點(diǎn)均為Ala，與國(guó)內(nèi)分離的HP-PRRSV毒株SY0608、JXA1、SX-1、Henan-1相 同，VR-2332、MLV、CH-1a株 均 為Val；第189位點(diǎn)分別均為L(zhǎng)eu或Val，而VR-2332、MLV株則為Ile；HB-BD2第194位點(diǎn)突變?yōu)镚ly；HB-SJZ1第191位點(diǎn)突變?yōu)镮le，HB-HS、HB-CZ、HB-HD為K。在中和表位（37～45）中，除HB-HS、HB-CZ、HB-HD為L(zhǎng)eu外，第39位點(diǎn)均為Ile，VR-2332、MLV株為L(zhǎng)eu，而CH-1a、HB-2（sh）株則為Phe，NADC30株為L(zhǎng)eu。這說(shuō)明23個(gè)流行毒株的氨基酸序列中抗原表位已發(fā)生變異，其中以HB-HS、HB-CZ、HB-HD株變異最大。

3 討論

自2006年發(fā)生HP-PRRS以來(lái)，河北省大中型豬場(chǎng)不斷采取以疫苗免疫為主的積極預(yù)防措施。但鑒于PRRSV的高變異及重組，需要不斷研究病毒的遺傳變異趨勢(shì)，從而保證疫苗防疫的有效性。從本次調(diào)查結(jié)果看，河北省23個(gè)流行毒株與國(guó)內(nèi)流行的高致病性毒株缺失情況相同，均在481位和532～560位缺失30個(gè)氨基酸。它們之間的同源性為89.5%～98.8%。調(diào)查中未發(fā)現(xiàn)經(jīng)典毒株，原因可能與本研究所選擇的發(fā)病豬場(chǎng)有關(guān)。因此，可以認(rèn)為目前在河北省主要以NSP2 基因組氨基酸缺失且位置相同為特征的美洲型PRRSV毒株流行為主。

ORF5基因進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，本研究中的20個(gè) 毒 株 與 SY0608、SX-1、Henan-1、JXA1形成一個(gè)分支，氨基酸同源性為98.5%～99.0%。HB-HS、HB-CZ、HB-HD 3個(gè)毒株與 NADC30、JZ1407、HN1502形成一個(gè)分支，氨基酸同源性為90.0%～92%，且同時(shí)存在不連續(xù)的30個(gè)氨基酸缺失， 即 為 HP-PRRSV。HB-HS、HB-CZ、HB-HD毒株可能是NADC30與HP-PRRSV基因重組形成的新毒株，但其是否具有NADC30毒株NSP2基因編碼蛋白131個(gè)氨基酸缺失的典型分子特征，還需再確證。NADC30毒株于2010年在美國(guó)首次被發(fā)現(xiàn)[16]，2014年在我國(guó)許多省份引發(fā)大規(guī)模母豬嚴(yán)重流產(chǎn)或早產(chǎn)[12，17]，并且呈逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)。有數(shù)據(jù)表明，NADC30-like PRRSV的出現(xiàn)與我國(guó)從北美進(jìn)口種豬有關(guān)[12，18-19]，因此需要加強(qiáng)進(jìn)口種豬的檢驗(yàn)檢疫工作，從源頭控制新型或未知病毒的傳入。

ORF5基因編碼病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，是PRRSV分子流行病學(xué)調(diào)查的最佳基因。ORF5 第13、151 位氨基酸變異可能影響毒株毒力[20]。本研究的23個(gè)分離株中，HB-HS、HB-HD、HB-CZ的第13位均發(fā)生了變異（突變?yōu)镻或Q），HBSJZ1、HB-HD、HB-CZ、HB-HS、HB-HS1、HB-HS2第151位突變?yōu)镵，其他第13、151 位均為精氨酸（R）。這說(shuō)明這些毒株可能具有強(qiáng)毒特性，而HB-HS、HB-HD、HB-CZ株變異最大，是以后的主要臨床研究對(duì)象。

4 結(jié)論

本研究應(yīng)用RT-PCR方法，從河北省10個(gè)地區(qū)18個(gè)發(fā)病豬場(chǎng)分別擴(kuò)增出23株缺失部分NSP2基因和完整ORF5基因的毒株，證實(shí)河北省存在PRRSV 變異株的流行；推導(dǎo)編碼氨基酸的比較結(jié)果表明，這些PRRSV毒株的ORF5基因編碼蛋白發(fā)生了較大變異，且其中3株為NADC30-like毒株，可能具有強(qiáng)毒性。本研究為河北省PRRSV的臨床診斷及有效防控提供了重要數(shù)據(jù)。

[1] WENSVOORT G.，TERPSTRA C，POL J M A，et al.Mystery swine disease in The Netherlands，the isolation of Lelystad virus[J]. Veterinary quarterly，1991，13（3）：121-130.

[2] MEULENBERG J J，HULST M M，DE MEIJER E J，et al.Lelystad virus，the causative agent of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome（PEARS），is related to LDV and EAV[J]. Virology，1993，192：62-72.

[3] 郭寶清，陳章水，劉文興，等. 從疑似PRRS流產(chǎn)胎兒分離豬生殖和呼吸綜合征病毒（PRRSV）的研究[J]. 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1996，87（2）：1-5.

[4] TIAN K，YU X，ZHAO T，et al. Emergence of fatal PRRSV variants：unparalleled outbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the unique hallmark[J]. Plos one，2007，2（6）：e526.

[5] ZHOU L，WANG Z，DING Y P，et al. NADC30-like strain of Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，China[J]. Emerging infectious diseases，2015，21（12）：2256-2257.

[6] WANG L J，XIE W，CHEN X X，et al. Molecular epidemiology of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in Central China since 2014：The prevalence of NADC30-like PRRSVs[J]. Microbial pathogenesis，2017，109：20-28.

[7] ZHANG M，LI X，CAI X，et al. Evaluation of infection status in Chinese swine with porcine reproductive and respiratory syndrome virus by nested RT-PCR targeting nsp2，gene[J]. Infection genetics & evolution journal of molecular epidemiology & evolutionary genetics in infectious diseases，2016，44：55-60.

[8] SUN Y F，ZHI L I，CHAO L U，et al. Isolation，identification and molecular epidemiology of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in Tianjin from 2014 to 2015[J]. Progress in veterinary medicine，2016.

[9] WANG P P，DONG J G，ZHANG L Y，et al. Sequence and phylogenetic analyses of the nsp2 and orf5 genes of Porcine reproductive and respiratory syndrome virus in boars from South China in 2015[J]. Transboundary &emerging diseases，2016.

[10] GUO Z，CHEN X X，LI R，et al. The prevalent status and genetic diversity of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in China：a molecular epidemiological perspective[J].Virology journal，2018，15（1）：2.

[11] ZHOU Z，WU J，ZHANG S，et al. Analysis of genetic variation of two nadc30-like strains of Porcine reproductive and respiratory syndrome virus in China[J].Open virology journal，2017，11（S1，M7）：90-97.

[12] 宋濤. PRRSV遺傳變異分析及其nsp2蛋白的定量相互作用組學(xué)研究[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

[13] ROQUCS E，GIRARD A，ST-LOUIS M C，et al.Immunogcnis and protective proper ties of GP5 and M structura l proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome virus expressed from replicating but nondisscminating adenovcctors[J]. Veterinary research，2013，44（1）：17.

[14] CAO Z X，JIAO P R，HUANG Y M，et al. Ucnetic diversity analysis of porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolated in South China from 2007 to 2009 based on ORF5 gene[J]. Acta veterinaria hungarica，2012，60（1）：157-164.

[15] HAN J，WANG Y，TAABERG K S，et al. Complete genome analysis of RFLP 184 isolates of porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].Virus research，2006，122（1/2）：175-182.

[16] BROCKMEIER S L，LOVING C L，VORWALD A C，et al. Genomic sequence and virulence comparison of four Type 2 porcine reproductive and respiratory syndrome virus strains[J]. Virus research，2012，169（1）：212-221.

[17] LI C，ZHUANG J，WANG J，et al. Outbreak investigation of nadc30-like PRRSV in South-East China[J]. Transboundary & emerging diseases，2016，63（5）：474-479.

[18] 張洪亮，張晶，李真，等. 2016年我國(guó)部分地區(qū)類(lèi)NADC30新亞群豬繁殖與呼吸綜合征病毒的遺傳變異分析[J]. 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2016，38（9）：675-680.

[19] JI G，LI Y，TAN F，et al. Complete genome sequence of an NADC30-like strain of Porcine reproductive and respiratory syndrome virus in China[J]. Genome announcements，2016，4（2）：e00303-16.

[20] ANSARI I H，KWON B，OSORIO F A，et al. In fluence of N-linked glycosylation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus GP5 on virus infectivity，antigenicity，and ability to induce neutralizing antibodies[J]. Journal of Virology，2006，80（8）：3994-4004.