劉佳 許天琪 薛曉艷

呼吸衰竭是指各種原因引起的肺通氣和（或）換氣功能障礙，靜息狀態(tài)下不能維持患者需要的氣體交換，導(dǎo)致低氧血癥伴（或不伴）高碳酸血癥，進(jìn)而引起一系列病理生理變化和相應(yīng)臨床表現(xiàn)的綜合征。臨床表現(xiàn)缺乏特異性，明確診斷依據(jù)動(dòng)脈血?dú)夥治?。呼吸衰竭是重癥醫(yī)學(xué)科收治的常見疾病，一個(gè)歐美16個(gè)國(guó)家40個(gè)重癥監(jiān)護(hù)室（ICU） 共同完成的流行病學(xué)調(diào)查顯示，32%的新入住ICU患者并發(fā)呼吸衰竭，24%的患者 ICU 住院期間并發(fā)急性呼吸衰竭，總發(fā)生率達(dá)56%，病死率達(dá)31%，顯著高于未合并呼吸衰竭者[1]。引起呼吸衰竭的病因多種多樣，有研究顯示肺源性因素引起的呼吸衰竭占大多數(shù)[2]，而感染性因素是肺源性呼吸衰竭最常見的原因。社區(qū)獲得性肺炎的病原學(xué)研究顯示，38%患者可查到致病原，而病毒占23%[3]。呼吸道病毒正逐漸成為住院社區(qū)獲得性肺炎患者的主要病原體。本研究擬對(duì)重癥醫(yī)學(xué)科呼吸衰竭患者進(jìn)行病毒學(xué)檢測(cè)與篩查，結(jié)合臨床資料進(jìn)行分析，旨在了解病毒與危重癥患者呼吸衰竭之間的相關(guān)性，為呼吸衰竭的病原學(xué)研究及針對(duì)性治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，選取2017年1月1日～12月31日在航天中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科住院、入院時(shí)或住院期間發(fā)生呼吸衰竭的患者。入選標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)大氣壓下、靜息條件下呼吸室內(nèi)空氣，并排除心內(nèi)解剖分流和原發(fā)心排量降低等情況后，動(dòng)脈氧分壓低于60mmHg，伴或不伴二氧化碳分壓高于50mmHg。排除標(biāo)準(zhǔn)：①住院時(shí)間不足72h；②年齡<18歲；③器官移植及長(zhǎng)期使用免疫抑制劑、長(zhǎng)期使用激素的患者。本研究所有患者均簽訂知情同意書，留取入選患者臨床資料及血?dú)夥治鼋Y(jié)果。同時(shí)選取同期住院非呼吸衰竭患者為對(duì)照組。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 用帶有聚丙烯纖維頭的拭子對(duì)鼻咽部標(biāo)本進(jìn)行采集，鼻拭子需在鼻腔內(nèi)停留15s，咽拭子采集需越過舌根，反復(fù)輕輕旋轉(zhuǎn)3次后，將拭子投入病毒運(yùn)送培養(yǎng)基中，折斷拭桿，使其完全置于管中，旋緊蓋冒做好標(biāo)記后密封，-20℃保存后送檢。留取咽拭子或鼻拭子同時(shí)采取靜脈血液標(biāo)本，無菌條件下勿傾斜或顛覆，2℃～8℃保存≤3d待檢或-20℃保存≤2個(gè)月待檢，凍融次數(shù)≤3次，進(jìn)行標(biāo)本保存。

1.2.2 臨床資料收集 記錄患者基本信息（包括性別、年齡等）、住院時(shí)間、序貫器官衰竭評(píng)分（SOFA評(píng)分）、APACHE Ⅱ評(píng)分、病死率。

1.2.3 樣本擴(kuò)增和檢測(cè) 在中科院分子發(fā)育生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病毒檢測(cè)。用呼吸道病原體及血液病原體多重檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢驗(yàn)。取研究對(duì)象標(biāo)本核酸提物 5μl，25℃孵育 5min，50℃變性 15min，95℃ 2min；按照 94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 60s，總共 35個(gè)循環(huán)進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增；再經(jīng)72℃10min擴(kuò)增產(chǎn)物延長(zhǎng)，于4℃環(huán)境保存。取擴(kuò)增產(chǎn)物1μl，加入去離子甲酰胺和LIZ-500 9μl混合，加樣于96孔測(cè)序板中，在95℃變性4min后，采用POP7膠毛細(xì)管電泳通過Genetic Analyzer 3500型測(cè)序儀（ABI PRISM 3500）進(jìn)行產(chǎn)物片段分析，觀察擴(kuò)增所得 PCR 產(chǎn)物電泳后峰型圖。采用S1000TMPCR儀、Centrifuge 5424R冷凍離心機(jī)、Bio-Rad SmartSpecTM3000分光光度計(jì)、Bio-Rad Power Pac 3000基礎(chǔ)電泳儀、XICHONG凝膠成像儀等進(jìn)行檢測(cè)。采用Magen MagPure Viral Nucleic Acid LQ for Abbott M2000 Kit磁珠法病毒總核酸提取試劑盒、康為世紀(jì)HiFiScript cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑、QIAGEN QIAxcel DNA Screening CartridgeGenStar StarPrep快速DNA膠回收試劑盒等進(jìn)行試劑的提純。

1.2.4 結(jié)果判讀 根據(jù)電泳所得峰型圖，與陽性對(duì)照中的特征峰進(jìn)行比較，得出研究對(duì)象所檢病毒種類。單一病毒檢出或同時(shí)有兩種及兩種以上的病毒檢出為陽性結(jié)果；單一拭子標(biāo)本檢出或血液標(biāo)本檢出，或是二者皆檢出，均視為陽性標(biāo)本。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Excel表格建立數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)資料進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析。采用SPSS 19.0軟件對(duì)資料進(jìn)行整理，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，非正態(tài)分布的計(jì)量資料用中位數(shù)（最大值，最小值）及平均數(shù)表示；組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以相對(duì)數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier生存分析法計(jì)算各組病死率并繪制生存曲線，采用Log-rank檢驗(yàn)比較生存曲線，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)圖表的描述及分析。

2 結(jié)果

2.1 兩組基本信息比較 2017年1月1日～12月31日共納入呼吸衰竭患者67例，排除住院時(shí)間不足72h患者5例，62例患者入選，以同期住院非呼吸衰竭患者62例作為對(duì)照組。共收集248例合格鼻/咽拭子及血液標(biāo)本。兩組患者基本信息見表1。

表1 兩組患者基本信息

2.2 兩組病毒檢測(cè)結(jié)果比較 248例臨床標(biāo)本中共檢測(cè)出11種病毒，呼吸道鼻/咽拭子標(biāo)本中檢出 5種，包 括 IFN（A/B）26例（20.9%），RhV 18例（14.5%），RSV 10例（8.1%），AdV 6例（4.8%），hMPV 2例（1.6%）；血液標(biāo)本中檢出6種，包括CMV 24例（19.4%），EBV 32例（25.8%），HSV 19例（15.3%），HHV 10例（8.1%），RuV 17例（13.7%），AdV 2例（1.6%）。呼吸衰竭組患者呼吸道鼻/咽標(biāo)本中IFN（A/B）、RhV、RSV、AdV及血液標(biāo)本中CMV、EBV檢出率高于非呼吸衰竭組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。其余檢測(cè)結(jié)果兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表2。

2.3 病毒陽性及陰性呼吸衰竭患者疾病嚴(yán)重程度比較 呼吸衰竭病毒檢出陽性患者APACHE Ⅱ評(píng)分及SOFA評(píng)分高于病毒檢出陰性患者，其中IFN（A/B）、AdV、EBV檢出陽性患者APACHE Ⅱ評(píng)分高于檢出陰性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；CMV 檢出陽性患者SOFA評(píng)分高于檢出陰性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表3。

2.4 病毒陽性及陰性呼吸衰竭患者住院時(shí)間和病死率比較 呼吸衰竭鼻/咽拭子標(biāo)本中IFN（A/B）、RhV、RSV以及血液標(biāo)本中CMV、EBV檢測(cè)陽性患者住院時(shí)間長(zhǎng)于陰性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。AdV陽性患者住院時(shí)間較陰性患者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見圖1。呼吸衰竭組血液標(biāo)本中EBV檢出陽性患者病死率與檢出陰性患者比較差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖2。

表2 兩組病毒檢測(cè)結(jié)果比較[n（%）]

表3 呼吸衰竭患者病毒檢出結(jié)果與疾病嚴(yán)重程度評(píng)分

圖1 呼吸衰竭患者住院時(shí)間

圖2 呼吸衰竭患者生存分析

3 討論

引起呼吸衰竭的病因較多，有研究顯示肺源性因素引起的危重患者呼吸衰竭占絕大多數(shù)[2]，原發(fā)肺部感染或疾病過程中合并肺部感染成為重癥患者呼吸衰竭的重要原因。由于檢測(cè)條件所限，以往對(duì)感染原的研究重點(diǎn)為細(xì)菌、真菌、非典型病原體，未對(duì)病毒足夠重視。近期研究顯示病毒可能是肺部感染尤其是重癥肺部感染的首要病原體[4～6]。也有研究顯示病毒感染在呼吸衰竭誘發(fā)因素中占重要地位[7]。從本研究結(jié)果可以看出，呼吸衰竭組患者的病毒檢出陽性率明顯高于非呼吸衰竭患者，檢出率最高的為流感病毒及鼻病毒，病毒分布情況與門診及普通病房患者所做病毒檢測(cè)結(jié)果大致相同[8]。

本研究顯示，呼吸衰竭患者鼻/咽拭子標(biāo)本中流感病毒及腺病毒檢測(cè)陽性與疾病嚴(yán)重程度之間具有相關(guān)性。呼吸衰竭患者血液標(biāo)本中出現(xiàn)多種病毒合并陽性，特別是巨細(xì)胞病毒及EB病毒，與患者的疾病嚴(yán)重程度及平均住院時(shí)間相關(guān)，其中EB病毒與患者病死率之間有相關(guān)性，雖不能明確呼吸衰竭患者死亡為病毒感染所致，但在對(duì)病毒種類的分析過程中發(fā)現(xiàn)，該院重癥醫(yī)學(xué)科住院患者無論是否呼吸衰竭，病毒的檢出種類與一項(xiàng)大型門診及住院流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)比較未見明顯差異[8]，但病毒檢出率方面明顯較其高，其中以流感病毒及鼻病毒的檢出率升高最為明顯。

目前公認(rèn)的常見導(dǎo)致病毒性肺炎的呼吸道病毒有甲、乙、丙型流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、鼻病毒、人類皰疹病毒、人偏肺病毒、人博卡病毒、冠狀病毒、腸道病毒、水痘帶狀皰疹病毒、漢坦病毒、副腸孤病毒、EB病毒、單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、麻疹病毒、迷你病毒等。但是患者所檢出病毒是否為導(dǎo)致患者重癥肺部感染乃至呼吸衰竭的主要病原體目前尚不明確，正如細(xì)菌培養(yǎng)陽性不能區(qū)分定植還是感染一樣，病毒也是廣泛存在，可以定植或者感染，區(qū)分要靠臨床資料，即患者是否處于病毒感染狀態(tài)。病毒感染往往啟動(dòng)全身免疫應(yīng)答反應(yīng)，形成瀑布級(jí)聯(lián)導(dǎo)致嚴(yán)重免疫紊亂和內(nèi)皮細(xì)胞廣泛受損，從而導(dǎo)致器官損傷乃至衰竭（如呼吸衰竭）的發(fā)生與發(fā)展。

有研究顯示，單一病毒感染是病毒性肺炎的主要形式[9]；其中患者的病情嚴(yán)重程度是引起患者呼吸衰竭發(fā)生與進(jìn)展的重要危險(xiǎn)因素，是體內(nèi)定植病毒處于定植或是感染狀態(tài)的關(guān)鍵，需要行病毒的載量檢測(cè)加以鑒別。而重癥患者因?yàn)樵诨A(chǔ)疾病的基礎(chǔ)上常合并多系統(tǒng)疾病，免疫狀態(tài)多處于紊亂或低下的狀態(tài)[10]。目前相關(guān)發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，可能的機(jī)制包括：①病毒感染導(dǎo)致炎癥反應(yīng)增高[11]；②病毒感染導(dǎo)致呼吸衰竭患者免疫功能紊亂，降低了機(jī)體對(duì)病原菌的防御能力[11]；③病毒感染與細(xì)菌感染形成惡性循環(huán)。國(guó)外一項(xiàng)針對(duì)病毒性肺炎的研究表明，感染甲型流感病毒（influenza A virus，IAV）的死亡患者肺部有明顯的肺泡損傷，且肺泡上皮細(xì)胞（alveolar epithelial cells，AEC）是最主要的感染細(xì)胞之一[12]，AEC也是維持肺泡上皮內(nèi)皮屏障功能的最主要細(xì)胞。AEC在IAV引起人畜禽共患性疾病過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。病毒引起肺泡上皮細(xì)胞表面活性物質(zhì)的合成和分泌障礙，破壞肺泡的完整性，增加肺泡毛細(xì)血管的通透性并通過影響免疫反應(yīng)和抑制中性粒細(xì)胞的趨化和吞噬作用以及對(duì)炎癥因子調(diào)節(jié)作用，影響呼吸系統(tǒng)對(duì)呼吸道病毒的防御能力，Qiu等[11]研究顯示合并呼吸衰竭的AECOPD 患者中約 47%檢測(cè)出病毒感染，病毒感染率明顯升高。合并呼吸衰竭的患者一般狀況會(huì)迅速惡化，機(jī)體出現(xiàn)耗氧增加和低氧合情況。貫序出現(xiàn)骨骼肌肉蛋白消耗增多、持續(xù)的氧化應(yīng)激和炎癥因子刺激、能量攝入不足等狀況， 最終會(huì)導(dǎo)致機(jī)體體液免疫、細(xì)胞免疫等清除病毒和防御能力降低[13]，從而對(duì)呼吸功能產(chǎn)生影響，出現(xiàn)呼吸衰竭。

本研究顯示，重癥醫(yī)學(xué)科呼吸衰竭患者呼吸道鼻/咽拭子標(biāo)本病毒核酸檢測(cè)以流感病毒、鼻病毒單獨(dú)或合并其他病毒存在最為多見，血液標(biāo)本病毒以巨細(xì)胞病毒及EB病毒多見，其中以EB病毒合并多種病毒較多見，與非呼吸衰竭組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。呼吸衰竭組內(nèi)IFN（A/B）、AdV、EBV檢出陽性患者APACHEⅡ評(píng)分、SOFA評(píng)分均高于病毒檢測(cè)陰性患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。CMV感染的唯一宿主是人類，在人體多處于潛伏狀態(tài)，當(dāng)機(jī)體的免疫出現(xiàn)紊亂時(shí)可激發(fā)CMV出現(xiàn)致死性癥狀[14]，這也是本研究中呼吸衰竭患者血液中巨細(xì)胞病毒檢出率及死亡率較高的原因。同樣在對(duì)EBV的研究中發(fā)現(xiàn)，EBV在大部分人群中處于潛伏狀態(tài)，引起EB病毒感染的主要機(jī)制可能為對(duì)上皮細(xì)胞的感染[15]，當(dāng)呼吸道上皮細(xì)胞出現(xiàn)感染時(shí)導(dǎo)致潛伏狀態(tài)的EBV啟動(dòng)入胞機(jī)制，產(chǎn)生EB病毒感染。

本研究具有一定的局限性，在對(duì)病毒種類檢測(cè)時(shí)缺乏對(duì)病毒載量的檢測(cè)，并且納入的樣本量較小，對(duì)最終結(jié)果產(chǎn)生一定影響，雖然已經(jīng)設(shè)定了病毒單因素與呼吸衰竭之間的關(guān)系，同時(shí)嚴(yán)格制定納入標(biāo)準(zhǔn)，盡量減少偏倚的發(fā)生，保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，但是本研究結(jié)果仍需要貫序、多中心研究進(jìn)一步證實(shí)，同時(shí)需對(duì)病毒的載量進(jìn)行檢測(cè)。

綜上所述，呼吸衰竭患者病毒檢出率高，住院時(shí)間延長(zhǎng)，病毒攜帶/感染可能是重癥醫(yī)學(xué)科呼吸衰竭患者的危險(xiǎn)因素，早期識(shí)別、提高認(rèn)識(shí)、早期防治可能對(duì)重癥呼吸衰竭患者的治療及預(yù)后產(chǎn)生一定的積極影響。

1 Vincent JL，Aka S，De Mendona A，et al.Sequntial organ failure assessment.The epidemiology of acute respiratory failure in critically ill patients[J].Chest，2002，121（5）：1602-1609

2 Andruska A，Micek ST，Shindo Y，et al.Pneumonia pathogen characterization is an independent determinant of hospital readmission[J].Chest，2015，148（1）：103-111

3 Daubin C，Parienti JJ，Vincent S，et al.Epidemiology and clinical outcome of virus-positive respiratory samples in ventilated patients： a prospective cohort study[J].Crit Care，2006，10（5）：R142

4 汪秀琴，張文艷，金晶.2014年-2015年合肥地區(qū)不明原因肺炎病例流感病毒核酸檢測(cè)結(jié)果分析[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2016，26（12）：1777-1779

5 林秀慧，張根生，崔巍.病毒性肺炎的診治進(jìn)展[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生，2017，55（5）：163-168

6 邱歡，黃升海.呼吸道病毒診斷的研究進(jìn)展[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2013，29（22）：3628-3629

7 Wu X， Chen D， Gu X， et al.Prevalence and risk of viral infection in patients with acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease： a meta-analysis [J].Mol Biol Rep，2014，41（7）：4743-4751

8 楊厚宇，王旻晉，梁宗安.呼吸道病毒核酸檢測(cè)結(jié)果分析[J].四川醫(yī)學(xué)，2017，38（4）：415-420

9 楊藝，陸小艷.病毒性肺炎患者病原學(xué)與外周血T淋巴細(xì)胞亞群水平研究 [J].國(guó)際病毒學(xué)雜志，2015，22（6）：424-426

10 錢永兵，謝暉，田銳，等.早期免疫功能麻痹在重癥甲型H1N1流感中的臨床意義[J].中華危重病急救醫(yī)學(xué)，2017，29（7）：581-585

11 Qiu Y， Zhu J， Bandi V， et al.Biopsy neutrophilia，neutrophilchemokine and receptor gene expression in severe exacerbations of chronic obstructive pulmonary disease [J].Am J Respir Crit Care Med，2003，168（8）：968-975

12 Shieh WJ，Blau DM，Denison AM，et al.2009 pandenllc infIuenza A（H1N1）：pathoIogy and path。genesis of 100 fataIcases in the united states[J].Am J Pathol，2010，177（1）：166-175

13 Schnell D， Gits-Muselli M， Canet E， et al.Burden of respiratory viruses in patients with acute respiratory failure[J].J Med Virol，2014，86（7）：1198-1202

14 Sekh M，Nichols WG，Papanicohou G，et al.Cytomegehvirus in hematopoietic stem cell transplant recipients：current status，known challenges，and future stralegies[J].Bid Blood Marrow Transplant，2003，9（9）：543-558

15 王艷，陳小毅．EB病毒潛伏感染與機(jī)體免疫關(guān)系的研究[J].西南軍醫(yī)，2012，14（2）：309-311