羅國(guó)慶 周晶晶 李關(guān)杰 梁計(jì)煥 劉秋華 李思文 胡寧東 夏旭

乳腺癌是全球威脅女性健康的主要疾病之一，我國(guó)乳腺癌的發(fā)病率正逐年上升，并且呈年輕化的趨勢(shì)[1]。淋巴道轉(zhuǎn)移是決定乳腺癌預(yù)后最重要的因素之一[2]。研究表明許多腫瘤存在淋巴管新生，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C （vascular endothelial growth factor C，VEGF-C） 是重要的促淋巴管生成因子[3]。VEGF-C可通過(guò)激活其特異性受體VEGFR-3促進(jìn)腫瘤內(nèi)淋巴管的生成，進(jìn)而促進(jìn)淋巴轉(zhuǎn)移；有研究發(fā)現(xiàn)VEGF-C還有促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移的功能，這些與腫瘤淋巴道播散轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)[3、4]。因此，VEGF-C可以作為治療與預(yù)防乳腺癌淋巴道轉(zhuǎn)移的靶點(diǎn)，降低體內(nèi)VEGF-C的表達(dá)水平有可能抑制乳腺癌淋巴管新生與淋巴道轉(zhuǎn)移。RNAi技術(shù)的不斷成熟，為有效降低VEGF-C的表達(dá)提供了重要的理論依據(jù)與技術(shù)支持。

本研究使用針對(duì)人VEGF-C基因的RNAi片段，以慢病毒為載體，感染體外培養(yǎng)的人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231，用Real-time PCR和Western blot方法檢測(cè)體外干擾后VEGF-C的表達(dá)水平變化；利用小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)慢病毒感染后乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的改變。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 細(xì)胞株 人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231，購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所（ATCC，USA）。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.1.2 siRNA慢病毒 購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司；VEGF-C-siRNA序列為5'-CCTCAACT CAAGGACAGAA-3'，陰性對(duì)照siRNA序列為5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'。VEGF-C-siRNA慢病毒以及陰性對(duì)照siRNA慢病毒的滴度分別為5×108TU/ml、2×109TU/ml，均攜帶綠色熒光標(biāo)記物。

1.1.3 主要試劑 含雙抗（青、鏈霉素）的細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI-1640、胎牛血清、胰蛋白酶購(gòu)自北京Solarbio生物科技有限公司。VEGF-C、GAPDH抗體購(gòu)自Santa公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和dNTP購(gòu)自Promega公司；Oligo dT購(gòu)自上海生工；SYBR Master Mixture購(gòu)自Takara公司；Cell Invasion Assay Kit購(gòu)自Chemicon International。

1.1.4 主要儀器 OLYMPUS IX70倒置相差顯微鏡（光學(xué)工業(yè)株式會(huì)社），電泳用穩(wěn)壓電源、SDSPAGE 蛋白電泳儀、蛋白轉(zhuǎn)膜儀（上海天能），MCO-17AICO2溫箱（日本SANYO），5417R臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)（Eppendorf公司），TDL-60B離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），恒溫水浴箱（山東環(huán)宇科研儀器廠），Real-time PCR儀器（Takara公司）。

1.2 方法

1.2.1 靶細(xì)胞慢病毒感染 目的細(xì)胞慢病毒感染實(shí)驗(yàn)在6孔板中進(jìn)行。細(xì)胞分成3組：未感染任何病毒的細(xì)胞組（CON組）、感染陰性對(duì)照病毒的細(xì)胞組（NC組）、感染RNAi靶點(diǎn)病毒的細(xì)胞組（KD組）。將細(xì)胞懸液（細(xì)胞數(shù)約為5×104）接種于6孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至細(xì)胞融合度約30%。根據(jù)病毒滴度值，KD組與NC組分別加入0.4μl、0.1μl的病毒。感染3d后觀察慢病毒上報(bào)告基因綠色熒光的表達(dá)情況，感染效率大于50%者繼續(xù)培養(yǎng)，感染7d后收集細(xì)胞抽提RNA進(jìn)行Real-time PCR及Western blot檢測(cè)；感染效率低于50%者重新進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)。感染效率定義為同一視野感染細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比。

1.2.2 Real-time PCR法檢測(cè)VEGF-C在靶細(xì)胞中的表達(dá) 根據(jù)Invitrogen公司的Trizol操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RNA提取，之后根據(jù)M-MLV操作說(shuō)明書(shū)（Promega公司）進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。引物序列為 Actin-F：5'-GGCGGCACCACCATGTACCCT-3'；Actin-R：5'-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3'；VEGFC-F：5'-AGGCTGGCAACATAACAGAGA-3'；VEGFC-R：5'-TCCCCACATCTATACACACCTC-3'。采用2-ΔΔCt法做相對(duì)定量分析。

1.2.3 Western blot法檢測(cè)VEGF-C在靶細(xì)胞中的表達(dá) 常規(guī)收獲細(xì)胞，超聲破碎儀破碎細(xì)胞，離心，取上清，BCA法測(cè)蛋白濃度，調(diào)整每個(gè)樣品蛋白終濃度為2 μg/μl。本實(shí)驗(yàn)采用10%的分離膠，5%的濃縮膠，每個(gè)樣品取20 μg總蛋白量上樣。在4℃、400 mA恒流條件下電轉(zhuǎn)120min，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用封閉液（含5%脫脂牛奶的TBST溶液）室溫封閉PVDF膜4℃過(guò)夜。一抗孵育：用封閉液按1∶100、1∶5000分別稀釋 VEGF-C、GAPDH抗體，然后與封閉好的PVDF膜室溫孵育4℃過(guò)夜。二抗孵育：用封閉液按1∶5000稀釋相應(yīng)的二抗，室溫下孵育PVDF膜2h。采用Amersham公司ECL+plusTM Western blotting system試劑盒進(jìn)行顯色。

1.2.4 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 用無(wú)血清培養(yǎng)基準(zhǔn)備細(xì)胞懸液，每個(gè)嵌入物中侵襲室接種2.5×104個(gè)細(xì)胞每孔，培養(yǎng)48～72h，移去非侵襲細(xì)胞。將嵌入物浸泡在染色液中20min，在膜的下表面染色侵入細(xì)胞，顯微鏡拍照，10%醋酸溶解，OD570檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，采用方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒載體感染效率 感染3d后在電子熒光顯微鏡下觀察每200倍鏡下的感染效率。經(jīng)觀察KD組與NC組感染效率均達(dá)到70%以上，CON組因?yàn)闆](méi)有轉(zhuǎn)染帶有綠色熒光標(biāo)記的慢病毒，因此在電子熒光顯微鏡下不顯像，見(jiàn)圖1～6。可見(jiàn)慢病毒有較高的感染效率。

圖1 KD組白光顯像（×200）

圖2 NC組白光顯像（×200）

圖3 CON組白光顯像（×200）

圖4 KD組熒光顯像（×200）

圖5 NC組熒光顯像（×200）

圖6 CON組熒光顯像（×200）

2.2 VEGF-C mRNA在目的細(xì)胞中的表達(dá) 通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)慢病毒感染7d后各組VEGF-C的表達(dá)情況。各組組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=5.14，P<0.05）。NC組與CON組表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；KD組較 CON組及 NC組表達(dá)明顯下調(diào)，沉默效率大于60%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。結(jié)果表明VEGF-C-siRNA能有效抑制VEGF-C mRNA的表達(dá)，陰性對(duì)照siRNA對(duì)VEGF-C的表達(dá)無(wú)影響。

表1 各組VEGF-C mRNA的表達(dá)水平

2.3 VEGF-C蛋白在目的細(xì)胞中的表達(dá) 慢病毒感染7d后按組抽提蛋白進(jìn)行蛋白印跡實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示：與CON組及NC組相比，KD組GAPDH條帶亮度幾乎無(wú)差異，而KD組細(xì)胞靶基因蛋白表達(dá)明顯減少，CON組與NC組無(wú)明顯差異。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了VEGF-C-siRNA在蛋白水平對(duì)靶基因的抑制及其作用的特異性。各組VEGF-C蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 各組VEGF-C蛋白表達(dá)

2.4 VEGF-C-siRNA對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲性的影響 通過(guò)細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢查感染3d后VEGF-C-siRNA和陰性對(duì)照siRNA對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲性的影響。在顯微鏡下觀察，染色后KD組顏色較NC組、CON組明顯變淡，見(jiàn)圖8～13。10%醋酸溶解，檢測(cè)KD組、NC組、CON組OD570的吸光值分別為0.181±0.001、0.247±0.005、0.254±0.003，組間差異明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=603.34，P<0.05）；與 NC組、CON組相比，VEGF-C-siRNA明顯抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲能力（P<0.05）；NC組與CON組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

圖8 KD組染色前顯像（×400）

圖9 NC組染色前顯像（×400）

圖10 CON組染色前顯像（×400）

圖11 KD組染色后顯像（×400）

圖12 NC組染色后顯像（×400）

圖13 CON組染色后顯像（×400）

3 討論

淋巴道轉(zhuǎn)移是乳腺癌最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移途徑之一，通過(guò)淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移情況可以協(xié)助乳腺癌分期和選擇治療方案[5]。淋巴管新生為腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移提供了重要的途徑。一系列關(guān)于淋巴管生成的分子機(jī)制和淋巴內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)記物的研究提示：在正常生物體和腫瘤的淋巴管生成中VEGF家族的成員 VEGF-C起著關(guān)鍵作用，其促進(jìn)淋巴管新生的作用通過(guò)與特異性受體VEGFR-3結(jié)合產(chǎn)生。乳腺癌中的VEGF-C過(guò)表達(dá)明顯提高瘤內(nèi)淋巴管生成因子的水平，而且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[6]。對(duì)比VEGF-C表達(dá)陰性的乳腺癌患者，VEGF-C表達(dá)陽(yáng)性的患者 5 年生存率低（P=0.035），因此VEGF-C有可能成為預(yù)測(cè)乳腺癌復(fù)發(fā)的標(biāo)記物[7]。既往研究顯示，VEGF-C產(chǎn)生于癌細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞，通過(guò)自分泌和旁分泌發(fā)揮作用，它誘導(dǎo)淋巴管新生及介導(dǎo)癌細(xì)胞淋巴道轉(zhuǎn)移的作用與其產(chǎn)生的量密切相關(guān)[8、9]。由此可見(jiàn)，抑制或者敲除VEGF-C的表達(dá)對(duì)預(yù)防與抑制乳腺癌的淋巴道轉(zhuǎn)移具有非常重要的作用。

使用病毒載體可以提高質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染效果穩(wěn)定且可轉(zhuǎn)染的細(xì)胞范圍廣泛，從而擴(kuò)大RNAi應(yīng)用范圍，因此病毒載體介導(dǎo)RNAi近年來(lái)受到重點(diǎn)關(guān)注[10，11]。本研究使用慢病毒作為載體，感染7d后采用實(shí)時(shí)定量PCR檢查，VEGF-C-siRNA對(duì)VEGF-C的沉默效果明顯，沉默效率大于60%，與陰性對(duì)照組以及空白對(duì)照組之間的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。慢病毒感染7d后按組抽提蛋白進(jìn)行蛋白印跡實(shí)驗(yàn)，從蛋白水平再次驗(yàn)證了VEGF-C-siRNA能穩(wěn)定有效抑制VEGF-C的表達(dá)。小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：對(duì)比陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組，在慢病毒感染3d后，VEGF-C-siRNA可降低腫瘤細(xì)胞的侵襲能力（P<0.05）。

綜上所述，使用siRNA技術(shù)以慢病毒為載體，可有效抑制人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 VEGF-C的表達(dá)，并能降低細(xì)胞的侵襲能力，為體外基因預(yù)防與治療乳腺癌淋巴道轉(zhuǎn)移提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為后續(xù)進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定了重要基礎(chǔ)。

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