王秀月 張廣潤 趙川 曹文艷 梁永娟 楚惠媛 陳徹 王勇

結腸癌是死亡率和發(fā)病率逐年升高的惡性腫瘤之一[1]。結腸癌患者發(fā)生肝轉移的概率高達50%，因此治療過程存在極大的困難[2，3]。有研究表明三氧化二砷（As2O3）對實體腫瘤有抑癌作用[4，5]。研究發(fā)現(xiàn)可以通過化療藥物與中藥聯(lián)用減少藥物毒副作用，并能發(fā)揮藥物最佳療效[6]。TanⅡA是中藥丹參中有效的脂溶性成分，具有抗腫瘤作用，可增強5-氟脲嘧啶（5-Fu）對人結腸癌的抗腫瘤作用[7，8]。目前關于TanⅡA聯(lián)合As2O3對結腸癌作用的研究很少。課題前期研究發(fā)現(xiàn)As2O3聯(lián)合TanⅡA明顯抑制結腸癌SW620細胞侵襲轉移[9]，本研究進一步探討As2O3聯(lián)合TanⅡA對人結腸癌SW620細胞的作用機制，以期為抗結腸癌侵襲轉移提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞株 人結腸癌SW620 細胞購自上海中科院細胞庫。

1.2 主要試劑及藥物 Leibovitz's L-15細胞培養(yǎng)基：GIBCO產(chǎn)品；胰蛋白酶（Trypsin）、胎牛血清：HyClone產(chǎn)品；PBS、青鏈霉素混合液、MTT試劑：北京索萊寶科技有限公司；TRIzol：美國Ambion公司；反轉錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒：美國Promega公司；引物：寶生物（大連）有限公司；5-Fu：上海旭東海普藥業(yè)有限公司；TanⅡA：上海第一生化藥業(yè)有限公司；As2O3：湖南省水口山礦務局衡陽實業(yè)總公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) 選用10%胎牛血清和100U/ml青鏈霉素混合液的Leibovitz's L-15細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，于37℃和5%CO2且飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱內，約2～3天傳代或換液1次。

1.3.2 細胞處理 實驗分為空白對照組、As2O3單藥組、TanⅡA單藥組、As2O3聯(lián)合TanⅡA用藥組、5-Fu干預組?？瞻讓φ战M：不用任何藥物治療。As2O3組：用2.5μg/ml的As2O3處理。TanⅡA組：用10μg/ml TanⅡA處理。As2O3+TanⅡA組：用As2O3（2.5μg/ml）和 TanⅡA（10μg/ml）處理。5-Fu組：用1 000μg/ml 5-Fu處理。

1.3.3 實時熒光定量PCR法檢測 SW620細胞中MMP9、VEGF、CD44v6、nm23-H1基因的表達 取對數(shù)生長期的SW620細胞，接種于培養(yǎng)瓶中，待細胞貼壁后，按實驗分組要求進行藥物干預。培養(yǎng)72h后收集各組細胞，用TRIzol提取細胞總RNA，并用Q5000微量紫外分光光度計測量RNA的濃度與純度，要求 D260/D280為1.8～2.2。取總RNA 5μg，應用反轉錄試劑盒（反應體系 20μl）合成cDNA。以 cDNA 為模板，按說明書要求對各組細胞的MMP9、VEGF、CD44v6及nm23-H1基因（β-actin為內參照）進行熒光定量 PCR 擴增（PCR引物序列見表1）。反應條件為：95℃ 2min；95℃ 15s；60℃30s；72℃ 30s，共 40個循環(huán)。2-ΔΔCt法計算各基因mRNA的相對表達水平。實驗重復3次。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學處理。實驗結果以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組內數(shù)據(jù)兩兩比較，采用LSD檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表1 RT-PCR引物序列

2 結果

各組藥物作用后 SW620細胞中 MMP9、VEGF、CD44v6和nm23-H1 mRNA的表達水平差異均有統(tǒng)計學意義（F=20.249；F=8.872；F=36.142；F=47.923，P<0.01）。與空白對照組相比，各用藥組MMP9、VEGF、CD44v6的 表達 量 顯 著 降 低（P<0.01），nm23-H1 mRNA的表達量明顯增高（P<0.01）；As2O3與TanⅡA聯(lián)合用藥組的MMP9、VEGF、CD44v6表達量明顯低于各單藥組（P<0.05），nm23-H1表達量與各單藥組相比，明顯上調（P<0.05）。各種藥物作用后SW620細胞中MMP9、VEGF、CD44v6及nm23-H1mRNA表達的RT-PCR檢測結果見圖1、2。

圖1 各組SW620細胞中MMP9、VEGFmRNA的表達

圖2 各組SW620細胞中CD44v6和nm23-H1mRNA的表達

3 討論

已有研究表明，As2O3和TanⅡA分別在結腸癌的治療過程中具有抑制結腸癌細胞轉移和侵襲的作用，然而課題前期研究證明兩者聯(lián)合應用能明顯抑制結腸癌細胞侵襲轉移。惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個復雜的生物學過程，主要與腫瘤轉移基因與腫瘤轉移抑制基因的表達失衡、細胞外基質降解、細胞黏附、腫瘤血管生成、腫瘤微環(huán)境的改變等因素有關。nm23-H1基因是侵襲與轉移相關基因，有研究表明其在高侵襲性的結腸癌SW620細胞中幾乎不表達，而上調nm23-H1基因的表達則可抑制SW620細胞的侵襲與轉移[10]。腫瘤細胞發(fā)展過程中，癌細胞必須先突破細胞外基質，向周圍生長，最終實現(xiàn)正常組織的侵襲及轉移。大量研究證實細胞外的金屬基質蛋白酶MMPs能調節(jié)腫瘤發(fā)展過程。MMP家族能夠調節(jié)腫瘤微環(huán)境的改變，具有降解細胞外基質的作用，其活化被認為是腫瘤細胞突破基膜以及降解細胞外基質的關鍵環(huán)節(jié)[11]。其中MMP2和MMP9被認為是目前發(fā)現(xiàn)的唯一可降解細胞外基質基本骨架Ⅳ型膠原蛋白的兩種水解酶，它們通過降解細胞外基質，從而促進癌細胞突破細胞外基質和基膜，為腫瘤的侵襲與轉移提供必要基礎。此外，大量研究發(fā)現(xiàn)CD44v6可作為黏附分子與 HA（hyaluronic acid， HA）交聯(lián)，改變細胞骨架的構象和分布，調節(jié)細胞的黏附和運動[12]，并在此基礎上募集MMPs，為腫瘤細胞的轉移和侵襲提供穩(wěn)定的微環(huán)境。腫瘤侵襲和轉移的另一個特征是新生血管的生成，VEGF是最重要的血管生長調節(jié)因子之一，可促進腫瘤血管的形成，為腫瘤細胞提供營養(yǎng)物質，腫瘤的高度血管化可促進腫瘤細胞進入血液循環(huán)系統(tǒng)，從而向遠處進行轉移和擴散[13]。因此，VEGF是阻斷腫瘤侵襲、轉移的重要靶點之一。本研究對兩藥聯(lián)合抗結腸癌細胞侵襲轉移作用機制做初步探討，應用實時熒光定量PCR檢測與侵襲轉移密切相關的MMP9、VEGF、CD44v6、nm23-H1基因。

前期實驗證明體外As2O3聯(lián)合TanⅡA用藥對SW620細胞的增殖具有協(xié)同抑制作用，還提示聯(lián)合用藥具有減毒并且顯著提高治療效果的雙重作用，為臨床結腸癌治療提供了聯(lián)合治療方案思路。因此As2O3聯(lián)合TanⅡA應用于結腸癌的治療可能是相對比較安全的用藥方案，本研究為探索結腸癌治療的分子機制提供了實驗理論依據(jù)。但是As2O3聯(lián)合TanⅡA抑制結腸癌細胞增殖的具體作用機制有待于進一步研究，體外實驗結果仍需要通過進一步體內實驗研究證明。

本研究采用實時熒光定量PCR實驗檢測SW620中 MMP9、VEGF、CD44v6、nm23-H1的mRNA表達，結果表明As2O3聯(lián)合TanⅡA對MMP9、VEGF、CD44v6基因具有明顯的抑制作用，對nm23-H1基因具有明顯的促進作用。因此，本研究在分子水平上預示了As2O3聯(lián)合TanⅡA能夠抑制結腸癌SW620細胞的侵襲和轉移。

綜上所述，As2O3聯(lián)合TanⅡA的抗結腸癌侵襲轉移作用與下調 MMP9、VEGF、CD44v6 ，上調nm23-H1的表達密切相關，抗腫瘤的復雜調控機制還需要深入研究。

1 Purushotham AD，Lewison G，Sullivan R.The state of researchand development in global cancer surgery[J].Ann Surg，2012，255（3）：427-432

2 陳沖，閆智勇.結腸癌肝轉移動物模型研究進展[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結合雜志，2012，21（1）：98-100

3 Zhang Q，Sha S，Xu B，et al.Prevalence of colorectal cancer in patients with ulcerative colitis：a retrospective，monocenter study in China[J].J Cancer Res Ther，2015，11（4）：899-903

4 Yi Y.Arsenic trioxide inhibits osteosarcoma cell invasiveness via MAPK signaling pathway[J].Cancer Biology & Therapy，2010，10（3）：251-257

5 Wang L， Hu X，Xu Y，et al.Arsenic trioxide inhibits lung metastasis of mouse colon cancer via reducing the infiltration of regulatory T cells[J].Tumour Biol，2016，37（11）：15165-15173

6 Chen YZ， Li ZD， Gao F， et al.Effects of combined Chinese drugs and chemotherapy in treating advanced non-small cell lung cancer[J].Chinese Journal of Integrative Medicine，2010，15（6）：415-419

7 Su CC.Tanshinone ⅡA potentiates the efficacy of 5-FU in Colo205 colon cancer cells in vivo through downregulation of P-gp and LC3-Ⅱ [J].Exp Ther Med，2012，3（3）：555-559

8 樊善繼.丹參酮ⅡA對SW480細胞增殖與凋亡的影響[D].南華大學，2014

9 王勇，王秀月，梁永娟，等.As2O3聯(lián)合丹參酮ⅡA對SW620細胞侵襲轉移能力的影響 [J].中國醫(yī)學創(chuàng)新，2017，14（28）：26-29

10 Qu L，Liang L，Su J，et al.Inhibitory effect of upregulated DR-nm23 expression on invasion and metastasis in colorectal cancer[J].Eur J Cancer Prev，2013，22（6）：512-522

11 Jiang Y， Goldberg ID， Shi YE.Complex roles of tissue inhibitors of metalloproteinases in cancer[J].Oncogene，2002，21（14）：2245-2252

12 Lokeshwar VB， Fregien N， Bourguignon LY.Ankyrin-binding domain of CD44（GP85） is required for the expression of hyaluronic acid-mediated adhesion function[J].Cell Biol，1994，126（4）：1099-1109 13 伊日貴.腫瘤侵襲轉移機制研究進展[J].中華實用診斷與治療雜志，2014，28（10）：937-939