崔芳芹 楊衛(wèi)東 陳前芬 趙云霞

(蚌埠醫(yī)學院病理生理學教研室，安徽 蚌埠 233030)

研究表明，腦缺血/再灌注損傷(CIRI)是大多數(shù)缺血性腦血管疾病的主要病理生理過程〔1〕，其發(fā)病機制尚不清楚，而細胞凋亡是CIRI最重要的機制之一〔2〕。目前認為Bcl-2是最重要的抗凋亡基因，具有抑制凋亡的作用。Caspase-3是促凋亡基因，是所有凋亡途徑的最后效應子，它們均在成熟腦組織中有少量表達。Bcl-2和Caspase-3表達的改變，將影響缺血神經(jīng)元的存活或死亡。再灌注損傷與缺血時間有很強的依賴關系，其缺血時間過短或過長，都不會造成嚴重的CIRI；只有在一定缺血時間段內(nèi)，恢復血供則易導致嚴重的CIRI。本實驗觀察不同缺血時間所引起的再灌注損傷小鼠腦神經(jīng)元細胞Bcl-2、Caspase-3 蛋白表達的變化。

1 材料與方法

1.1試劑 Bcl-2和Caspase-3的抗體和SP免疫組化試劑盒均購于北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2動物與分組 健康昆明種小鼠50只，體重(25±5)g，雌雄兼用，由我院實驗動物科提供，隨機均分為五組。假手術組:僅行手術，不實施腦缺血；缺血-再灌注(I/R)Ⅰ組:缺血30 min，再灌注1 h；I/RⅡ組:缺血60 min，再灌注1 h；I/RⅢ組: 缺血90 min，再灌注1 h；I/RⅣ組:缺血120 min，再灌注1 h。上述全腦CIRI動物模型的建立，均采用我室改進的小鼠全腦CIRI的動物模型〔3〕，且在10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)小鼠腹腔注射麻醉后進行。

1.3標本制備 各組動物動態(tài)觀察到預定的時間后，用20%烏拉坦過量麻醉處死，開顱，取出小鼠大腦，用10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，48 h 后于乳頭體及視交叉平面行冠狀切開，制成腦組織切片(厚度為3 μm)。

1.4免疫組織化學染色 采用免疫組織化學SP法染色：①石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，檸檬酸鹽緩沖液修復；②3%H2O2，37℃孵育15 min；③山羊血清封閉，37℃孵育30 min，勿洗；④一抗為兔抗鼠Bcl-2和Caspase-3抗體，稀釋濃度均為1∶100，4℃過夜；⑤ 37℃孵育30 min；⑥二抗為生物素標記的山羊抗兔的IgG，37℃孵育15 min；⑦辣根酶標記鏈酶卵白素工作液，37℃孵育30 min；⑧以上各步驟之間都磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次×5 min；⑨ DAB顯色3 min，自來水沖洗；⑩蘇木精復染2 min，自來水沖洗，脫水，透明和封片。用PBS替代第一抗體作為陰性對照。

1.5計算機圖像分析 在10×40倍光鏡下，利用Nikon彩色數(shù)碼CCD攝像頭捕獲各組免疫組化染色切片中Bcl-2和Caspase-3的圖像，每張切片隨機選取5個視野，再用metamorph生物圖像軟件計算各組Bcl-2和Caspase-3免疫陽性細胞的平均光密度(MOD)值。

2 結 果

2.1免疫組織化學染色結果 在各組小鼠腦組織Bcl-2和Caspase-3免疫組織化學染色切片中，高倍鏡下，可見假手術組Bcl-2和Caspase-3免疫反應陽性物主要沉積在大腦上皮神經(jīng)元細胞的胞質(zhì)內(nèi)，呈淺棕色，細胞核呈陰性反應；I/RⅠ組腦神經(jīng)元細胞內(nèi)Bcl-2和Caspase-3表達較假手術組增強，呈棕黃色；I/RⅡ組腦神經(jīng)元細胞內(nèi)Bcl-2和Caspase-3表達較假手術組明顯增強，呈棕褐色；I/RⅢ組腦神經(jīng)元細胞內(nèi)Bcl-2表達較I/RⅡ組明顯減少；I/RⅣ組腦神經(jīng)元細胞內(nèi)Bcl-2表達I/RⅡ組顯著減少；I/RⅢ組腦神經(jīng)元細胞內(nèi)Caspase-3表達較假手術組顯著增強，呈深棕色；I/RⅣ組腦神經(jīng)元細胞內(nèi)Caspase-3表達I/RⅢ組顯著減少，呈棕色。見圖1，圖2。

圖1 小鼠腦神經(jīng)元細胞內(nèi)Bcl-2表達(SP法，×400)

圖2 小鼠腦神經(jīng)元細胞內(nèi)Caspase-3表達(SP法，×400)

2.2計算機圖像分析結果 在一定缺血時間范圍內(nèi)，Bcl-2隨缺血時間的延長而表達增加，其中I/RⅡ組Bcl-2的MOD值分別與假手術組和I/RⅠ組比較，均有顯著差異(P<0.05)；但缺血時間進一步延長，I/RⅢ組和I/RⅣ組Bcl-2表達逐漸減少，分別與I/RⅡ組的MOD值比較均有顯著差異(P<0.05)。Caspase-3表達隨著缺血時間的延長而不斷增加，I/RⅠ組、I/RⅡ組和I/RⅢ組Caspase-3的MOD值分別與假手術組比較，差異均有顯著性(P<0.05)；I/RⅡ組和I/RⅢ組Caspase-3的MOD值分別與I/RⅠ組比較均有顯著差異(P<0.05)；I/RⅡ組和I/RⅢ組Caspase-3的MOD值相互比較有顯著差異(P<0.05)；但缺血時間過久，I/RⅣ組Caspase-3減弱，與I/RⅢ組Caspase-3的MOD值比較有顯著差異(P<0.05)。見表1。

表1 五組小鼠腦神經(jīng)元細胞內(nèi)Bcl-2和Caspase-3的MOD值比較

3 討 論

據(jù)WHO調(diào)查表明腦血管意外引起的死亡率占所調(diào)查的57個國家死亡總人數(shù)的11.3%, 僅次于癌癥和心肌梗死，腦缺血是腦血管疾病最主要的病種, 在我國其死亡率僅次于惡性腫瘤, 嚴重危害人類的健康〔4〕。目前對腦缺血性疾病的防治，仍然是全社會和醫(yī)學界關注的重要課題〔5〕。CIRI是大多數(shù)缺血性腦血管疾病的主要病理生理過程，其發(fā)病機制不是很清楚，主要有自由基學說、鈣超載學說、線粒體功能障礙及遲發(fā)型神經(jīng)元死亡(DND)學說等〔6〕。腦缺血后缺血中心區(qū)域的神經(jīng)元很快出現(xiàn)死亡，但其周圍的神經(jīng)元卻發(fā)生遲發(fā)性神經(jīng)元死亡，已證明這種遲發(fā)性死亡主要是細胞凋亡，它的發(fā)生受許多細胞外因素和細胞內(nèi)基因的調(diào)節(jié)〔3〕；如何減輕CIRI缺血半暗帶區(qū)的細胞凋亡，對缺血性腦血管疾病患者的預后具有決定性的作用。目前認為Bcl-2基因家族在凋亡中發(fā)揮重要作用, Bcl-2在腦內(nèi)的過量表達可增強腦組織對缺血性損傷的耐受性, Bcl-2可以通過與Bax競爭結合, 形成異源二聚體, 封閉Bax形成孔道的活性, 阻止ctyc穿過線粒體膜進入細胞質(zhì), 從而抵抗細胞凋亡〔7〕，因此調(diào)節(jié)其基因表達對腦缺血具有重要的治療潛力。近年研究發(fā)現(xiàn)，Caspase 家族在凋亡過程中起重要作用，凋亡的最后過程是通過Caspase 的激活而實現(xiàn)的〔8〕。Caspase-3是參與凋亡Caspase 級鏈反應最終效應子，在蛋白酶級聯(lián)切割過程中處于核心位置，在正常情況下以無活性的酶原形式存在于胞質(zhì)中，在凋亡的早期階段不同的蛋白酶切割Caspase-3 酶原，從而激活Caspase-3；活化的Caspase-3又進一步切割不同的底物，導致蛋白酶級聯(lián)切割放大，最終使細胞死亡。Caspase-3 是多種凋亡途徑的共同下游效應部分，細胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應的必經(jīng)之路，在凋亡的信息傳遞中居于核心地位，因此Caspase-3在細胞凋亡早期啟動與執(zhí)行過程中起重要作用〔9〕，是細胞凋亡發(fā)生的關鍵酶。

缺血后再灌注可能造成更嚴重的損傷，但并不是所有缺血的器官在血流恢復后都會發(fā)生CIRI，許多因素可以影響其發(fā)生及其嚴重程度，其中最主要的因素是缺血時間。缺血時間短，恢復血供后可無明顯的再灌注損傷，因為所有器官都能耐受一定時間的缺血。缺血時間長，恢復血供則易導致CIRI；若缺血時間過長，缺血器官會發(fā)生不可逆性損傷。再灌注損傷與缺血時間的依賴關系，提示在缺血過程中組織發(fā)生的某些變化，是再灌注損傷發(fā)生的基礎，再灌注損傷的實質(zhì)就是將缺血期的可逆性損傷經(jīng)恢復血流后進一步加重或轉化為不可逆性損傷。本實驗研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2、Caspase-3在正常的腦神經(jīng)元細胞的胞漿內(nèi)均有少量的表達。I/RⅢ、I/RⅣ組隨著缺血時間的進一步延長，而Bcl-2的表達越來越弱，這可能與腦組織長時間缺血導致細胞能量代謝障礙有關〔2〕。Caspase-3 的活化是細胞凋亡的早期生物化學指標，并與細胞凋亡的形態(tài)學表現(xiàn)相互關聯(lián)〔10〕。

綜上，在缺血后的受損神經(jīng)元中, 凋亡啟動和凋亡抑制基因均有上調(diào), 凋亡啟動基因代表細胞死亡趨勢, 凋亡抑制基因過度表達代表內(nèi)源性神經(jīng)保護機制。若早期應用Caspase 抑制劑，能有效抑Caspase 活性的增加，減少神經(jīng)細胞的凋亡，改善神經(jīng)細胞功能〔11〕。在細胞凋亡過程中，Bcl-2及其家族成員起重要作用，它們共同構成一個非常復雜的相互作用網(wǎng)絡，抑制細胞凋亡，在腦缺血早期采用積極的方法促進Bcl-2基因的表達，可能會減輕神經(jīng)系統(tǒng)的損害〔12〕。

4 參考文獻

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