李 勝 劉 魏 季衛(wèi)鋒 鐘 瑩 童培建

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053）

膝骨關(guān)節(jié)炎（KOA）在臨床上較為常見，臨床表現(xiàn)主要為疼痛及關(guān)節(jié)功能障礙。現(xiàn)多數(shù)學(xué)者認(rèn)為KOA病變的核心是關(guān)節(jié)軟骨退行性改變致軟骨丟失、破壞伴有關(guān)節(jié)周圍骨質(zhì)增生性反應(yīng)［1］。由于關(guān)節(jié)軟骨缺乏自我修復(fù)能力，故治療比較困難。目前對(duì)早期KOA患者，臨床治療的原則是減輕患者疼痛，改善患者生活質(zhì)量，緩解關(guān)節(jié)軟骨破損。常用方法包括口服非甾體類抗炎藥，雖能緩解患者疼痛，但胃腸道等副作用頗多［2］；自體干細(xì)胞關(guān)節(jié)腔注射，雖有不錯(cuò)的臨床療效，但費(fèi)用昂貴、提取設(shè)備無法普及，血制品監(jiān)管程序繁雜等限制其臨床的推廣應(yīng)用。補(bǔ)腎活血方為傷科經(jīng)典方，有補(bǔ)腎壯筋，活血止痛之功效［3-4］。本研究運(yùn)用補(bǔ)腎活血方加減對(duì)KOA大鼠模型進(jìn)行干預(yù)，探討補(bǔ)腎活血方加減對(duì)KOA大鼠模型疼痛及軟骨損傷的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠50只，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCKK（滬）2007-0005。 體質(zhì)量（230±20）g，動(dòng)物觀察室溫度（25±1） ℃，相對(duì)濕度（60±10）%。適應(yīng)性喂養(yǎng)訓(xùn)化1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 試藥與儀器 中藥制備：補(bǔ)腎活血方加減由浙江中醫(yī)藥大學(xué)門診部提供，組成：熟地黃12 g，杜仲3 g，蜈蚣 1 g，菟絲子 9 g，當(dāng)歸尾 3 g，桃仁 3 g，山茱萸肉6 g，紅花 3 g，獨(dú)活 3g，川牛膝 3 g，枸杞 3 g。 中藥飲片均來自浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥廠，煎液濃縮成1 g/mL（浙江中醫(yī)藥大學(xué)骨研所制備）。試劑與儀器：碘乙酸（SIGMA-ALDRICH）；YLS-3E電子壓痛儀（安徽省淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司），37370足底熱測(cè)痛儀（浙江中醫(yī)藥大學(xué)骨研所實(shí)驗(yàn)室提供），AXiovert200熒光倒置顯微鏡。

1.3 分組與造模 為避免灌胃時(shí)所致的應(yīng)激影響，于實(shí)驗(yàn)前1周開始每日灌胃針訓(xùn)化處理。取50只SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、補(bǔ)腎活血方低、中、高劑量組，每組10只?？瞻捉M不進(jìn)行造模處理，其余4組大鼠通過向雙側(cè)膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)腔注射25 mg/mL碘乙酸50 μL 進(jìn)行 KOA 造模［3］。

1.4 干預(yù)方法 造模后第2日開始給藥，空白組和模型組按10 mL/kg予0.9%氯化鈉注射液灌胃，補(bǔ)腎活血方低、中、高劑量組根據(jù)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人體表面積等效量換算比例》［4］進(jìn)行給藥，中劑量給藥相當(dāng)于正常成人量。按正常人（70 kg）每日1劑的藥物量（49 g），大鼠（200 g）與成人（70 kg）的劑量折算系數(shù) 6.3，則 230 g大鼠的等效劑量為（49÷70）×6.3×0.23=1 g，低劑量為中劑量的一半為0.5 g，高劑量為中劑量+（0.65×中劑量）=1.7 g。綜上可得，補(bǔ)腎活血湯低劑量組每日灌胃0.5 mL，中劑量每日灌胃1 mL，高劑量組每日灌胃1.7 mL，連續(xù)灌胃4周。

1.5 觀察指標(biāo) 1）大鼠壓痛閾值測(cè)定：分別于造模后后第2日和第4周采用YLS-3E電子壓痛儀測(cè)定各組大鼠的壓痛閾值（以動(dòng)物疼痛后的嘶鳴作為痛閾指標(biāo)）。2）大鼠熱痛閾值測(cè)定：每次壓痛閾值測(cè)定后6 h，采用足底熱痛測(cè)試儀測(cè)定各組大鼠雙側(cè)后足趾熱痛閾值。每只大鼠測(cè)定3次，取平均值，每次間隔5～10 min。3）大鼠膝關(guān)節(jié)軟組織病理學(xué)觀察：連續(xù)灌胃4周，最后一次熱痛閾值測(cè)定結(jié)束后，所有大鼠麻醉后斷頸處死。取大鼠雙側(cè)膝關(guān)節(jié)標(biāo)本放入4%多聚甲醛中溶液固定，硝酸脫鈣、沖洗、梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片（沿膝關(guān)節(jié)矢狀面將脛骨內(nèi)側(cè)平臺(tái)軟骨下松質(zhì)骨和股骨內(nèi)側(cè)髁軟骨下松質(zhì)骨沿下肢縱軸方向切片，厚度約5 μm），番紅O染色。光鏡下觀察軟骨組織病理學(xué)改變，按軟骨損傷 Mankin′s 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［5］，從軟骨結(jié)構(gòu)、細(xì)胞改變、基質(zhì)染色、潮線完整性評(píng)價(jià)軟骨的病變程度，所得分?jǐn)?shù)疊加后，得出評(píng)分結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，采用配對(duì)t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠壓痛閾值測(cè)定結(jié)果比較 見表1。造模后第2日，與空白組比較，模型組、補(bǔ)腎活血方低、中、高劑量組大鼠壓痛閾值均偏低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），而模型組與補(bǔ)腎活血方低、中、高劑量組大鼠壓痛閾值比較無明顯差異（均P＞0.05）。連續(xù)灌胃4周后，模型組大鼠壓痛閾值低于空白組、補(bǔ)腎活血方低、中、高劑量組（均P＜0.05），補(bǔ)腎活血方高劑量組大鼠壓痛閾值高于低、中劑量組（均P＜0.05），補(bǔ)腎活血方中劑量組大鼠壓痛閾值高于低劑量組（P＜0.05）。

表1 各組大鼠壓痛閾值測(cè)定結(jié)果比較（kPa，±s）

表1 各組大鼠壓痛閾值測(cè)定結(jié)果比較（kPa，±s）

與模型組比較，*P＜0.05；與空白組比較，△P＜0.05；與補(bǔ)腎活血方高劑量組比較，▲P＜0.05；與補(bǔ)腎活血方中劑量組比較，#P＜0.05。下同。

組 別 n 造模后第2日 造模后4周空白組 10 446.13±20.89 453.21±26.48*模型組 10 174.09±19.63△ 164.23±21.32補(bǔ)腎活血方低劑量組 10 171.01±19.30△ 221.49±19.38*▲#補(bǔ)腎活血方中劑量組 10 173.45±18.69△ 273.78±12.96*▲補(bǔ)腎活血方高劑量組 10 168.55±9.06△ 373.31±32.52*

2.2 各組大鼠熱痛閾值測(cè)定結(jié)果比較 見表2。造模后第2日，與空白組比較，模型組、補(bǔ)腎活血方低、中、高劑量組大鼠熱痛閾值均偏低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而模型組與補(bǔ)腎活血方低、中、高劑量組大鼠熱痛閾值比較無明顯差異（均P＞0.05）。連續(xù)灌胃4周后，模型組大鼠熱痛閾值低于空白組、補(bǔ)腎活血方中、高劑量組（均P＜0.05），補(bǔ)腎活血方低劑量組大鼠熱痛閾值與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），補(bǔ)腎活血方高劑量組大鼠熱痛閾值高于低、中劑量組（均P＜0.05），補(bǔ)腎活血方中劑量組大鼠熱痛閾值高于低劑量組（P＜0.05）。

表2 各組大鼠熱痛閾值測(cè)定結(jié)果比較（s，±s）

表2 各組大鼠熱痛閾值測(cè)定結(jié)果比較（s，±s）

組 別 n 造模后第2日 造模后4周空白組 10 9.33±0.54 8.93±0.65*模型組 10 4.52±0.44△ 4.38±0.69補(bǔ)腎活血方低劑量組 10 4.41±0.40△ 4.34±0.53▲#補(bǔ)腎活血方中劑量組 10 4.40±0.45△ 6.80±0.68*▲補(bǔ)腎活血方高劑量組 10 4.33±0.61△ 8.70±0.62*

2.3 大鼠膝關(guān)節(jié)軟組織病理學(xué)觀察 見圖1。空白組大鼠軟骨表面平整，潮線連續(xù)完整，細(xì)胞排列規(guī)則，軟骨基質(zhì)染色均勻，呈現(xiàn)紅色；模型組大鼠軟骨表面明顯缺損，軟骨基質(zhì)染色明顯減輕、不均，細(xì)胞排列紊亂，潮線紊亂不連續(xù)紊亂。連續(xù)灌胃4周后，補(bǔ)腎活血方低、中、高劑量組軟骨形態(tài)較模型組改變，軟骨基質(zhì)染色也有不同程度加深，潮線也有不同程度改變。其中以補(bǔ)腎活血方加減高劑量組改善最為明顯，軟骨表面基本恢復(fù)正常，可見少許肥大軟骨細(xì)胞，潮線清晰，軟骨基質(zhì)染色加深最為明顯，均勻；中劑量組軟骨表面仍有缺損，軟骨細(xì)胞大量存活，軟骨基質(zhì)染色加深，但不及高劑量組，欠均勻；低劑量組軟骨組織缺損輕度改善，軟骨細(xì)胞丟失，肥大化，潮線欠清晰，軟骨基質(zhì)染色加深，不及高、中劑量組。

圖1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟組織病理切片（番紅O染色，100倍）

2.4 各組軟骨損傷Mankin′s評(píng)分比較 見表3。與空白組大鼠比較，其余4組大鼠軟骨損傷Mankin′s評(píng)分均偏高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中補(bǔ)腎活血方中劑量組大鼠軟骨損傷Mankin′s評(píng)分低于低劑量組（P＜0.01），補(bǔ)腎活血加減高劑量組軟骨損傷Mankin′s評(píng)分低于中、低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表3 各組大鼠軟骨損傷Mankin′s評(píng)分比較（分，±s）

表3 各組大鼠軟骨損傷Mankin′s評(píng)分比較（分，±s）

組 別 n Mankin′s評(píng)分空白組 10 1.20±0.79模型組 10 8.50±1.58△補(bǔ)腎活血方低劑量組 10 6.70±1.34△▲#補(bǔ)腎活血方中劑量組 10 4.60±0.97△▲補(bǔ)腎活血方高劑量組 10 2.60±1.26△

3 討 論

KOA患者早期常以膝關(guān)節(jié)疼痛為主，伴或不伴活動(dòng)受限，Stoppiello認(rèn)為這可能與軟骨細(xì)胞完整性的丟失和軟骨形態(tài)改變有關(guān)［6］。臨床上X線片可見骨贅形成，膝關(guān)節(jié)間隙可疑變窄（以內(nèi)側(cè)間隙變窄為多見）。目前治療KOA所遵循的原則是保護(hù)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)成分和調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞功能［7］。常用藥物氨基葡萄糖、硫酸軟骨素，但美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院資助的研究顯示氨基葡萄糖在減輕膝關(guān)節(jié)疼痛方面并沒有明顯優(yōu)于安慰劑［8］，F(xiàn)ranse M 等［9］經(jīng)研究認(rèn)為硫酸軟骨素在改變膝關(guān)節(jié)軟骨方面也沒有明顯療效。

KOA屬于中醫(yī)“痹證”范疇。在國(guó)內(nèi)，中醫(yī)治療早期KOA具有很明顯的特色和優(yōu)勢(shì)，副作用少，療效確切。膝關(guān)節(jié)痹證是由邪氣滯留于經(jīng)絡(luò)，導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)疼痛、腫脹的癥狀，“正氣不存，邪氣可干”，正氣不足是膝關(guān)節(jié)痹證的內(nèi)在因素，夾雜風(fēng)、瘀、痰、濕等實(shí)證。臨床大樣本研究顯示KOA以肝腎虧虛多見［10］；亦有學(xué)者采用聚類分析法研究表明KOA以脾腎陽虛、肝腎虧虛、氣滯血瘀多見［11］，另有流行病學(xué)結(jié)果表明腎虛夾瘀夾濕為KOA重要發(fā)病原因［12］。由此筆者認(rèn)為KOA患者主要以肝腎虧虛伴或不伴血瘀氣滯為多見。補(bǔ)腎活血方原方源于《傷科大成》，現(xiàn)代醫(yī)家以該方為基礎(chǔ)進(jìn)行不斷增減演變，運(yùn)用于臨床疾病的治療，目前該方已成為中醫(yī)藥學(xué)者研究的熱門?，F(xiàn)筆者運(yùn)用補(bǔ)腎活血方加減對(duì)KOA大鼠模型進(jìn)行干預(yù)，觀察模型大鼠的疼痛及膝關(guān)節(jié)的軟骨變化。

本研究之大鼠壓痛和熱痛閾值結(jié)果顯示，連續(xù)灌胃補(bǔ)腎活血方加減4周后，模型組大鼠壓痛閾值低于空白組、補(bǔ)腎活血方低、中、高劑量組（P＜0.05），補(bǔ)腎活血方高劑量組大鼠壓痛閾高于低、中劑量組（P＜0.05），補(bǔ)腎活血方中劑量組大鼠壓痛閾值高于低劑量組（P＜0.05）。模型組大鼠熱痛閾值低于空白組，補(bǔ)腎活血方中、高劑量組（P＜0.05），補(bǔ)腎活血方低劑量組大鼠熱痛閾值與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，補(bǔ)腎活血方高劑量組大鼠、中劑量組大鼠熱痛閾值，補(bǔ)腎活血方加減中劑量組大鼠熱痛閾值高于低劑量組（P＜0.05）。補(bǔ)腎活血方低、中、高劑量組軟骨損傷Mankin′s評(píng)均低于模型組（P＜0.05），其中中、高劑量組均較低，提示補(bǔ)腎活血方加減能修復(fù)大鼠軟骨損傷，并與藥物劑量呈正相關(guān)性。結(jié)果證明，補(bǔ)腎活血方加減能提高膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型疼痛閾值，修復(fù)其膝關(guān)節(jié)軟骨損傷，并與藥物劑量呈正相關(guān)性。

近年來，在膝關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制研究中，細(xì)胞因子的介導(dǎo)作用日趨受到重視。TNF-α既有協(xié)同細(xì)胞介素（IL-1）的作用，又可激活I(lǐng)L-6基因、誘導(dǎo)IL-6生成，在膝骨關(guān)節(jié)炎（OA）的發(fā)生、發(fā)展中起到?jīng)Q定性作用［13］。亦有研究證實(shí)IL-1是骨性關(guān)節(jié)炎（OA）病理過程中介導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨破壞最重要的細(xì)胞因子，在OA的軟骨細(xì)胞、關(guān)節(jié)滑液及滑膜組織均能檢測(cè)較高水平的IL-Iβ和TNF-α。國(guó)外研究亦證實(shí)，IL-1β在軟骨細(xì)胞的降解及退變起重要的分解作用，加重關(guān)節(jié)的炎癥反應(yīng)，增加破骨細(xì)胞的活性，促進(jìn)骨質(zhì)吸收［14］。國(guó)內(nèi)中醫(yī)學(xué)者應(yīng)用補(bǔ)腎活血方對(duì)體外培養(yǎng)的滑膜細(xì)胞及軟骨細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)該方可以抑制滑膜細(xì)胞分泌IL-Iβ和TNF-α，同時(shí)還可以增強(qiáng)軟骨細(xì)胞的增殖能力［15］。綜上所述，補(bǔ)腎活血方加減能提高膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型疼痛閾值，修復(fù)其膝關(guān)節(jié)軟骨損傷，其作用機(jī)制可能與該方能夠抑制膝關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞分泌IL-Iβ和TNF-α，進(jìn)而控制膝關(guān)節(jié)炎癥的進(jìn)展，同時(shí)增強(qiáng)膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖能力，加速關(guān)節(jié)修復(fù)有關(guān)。

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