武中庸，趙吳靜，侯 曉，蒲萬霞

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院新獸藥工程重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730050）

抗生素耐藥性與抗生素的使用相生相伴。某些環(huán)境微生物本身攜帶或者能夠從其他菌株獲得某些特定基因，這些基因能夠通過編碼具有不同功能的蛋白質(zhì)以達(dá)到去除抗生素效應(yīng)的目的，其被稱為抗生素耐藥基因（Antibiotic resistance genes，ARGs）［1］。Rysz 等于 2004 年將ARGs歸納為一類新型環(huán)境污染物，Pruden等于2006年正式明確提出這一概念，從此ARGs愈受關(guān)注。ARGs可分為“內(nèi)源性耐藥基因”和“外源性耐藥基因”。內(nèi)源性耐藥基因主要指本身存在于基因組上的耐藥基因原型、準(zhǔn)耐藥基因及平時(shí)未表達(dá)的耐藥基因，其能夠隨機(jī)突變或通過外部選擇壓力表達(dá)耐藥性。D’Costa等［2］從北極3萬年凍土中發(fā)現(xiàn)，對β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類和糖肽類等抗生素具有抗性的ARGs，且萬古霉素耐藥蛋白結(jié)構(gòu)和功能與現(xiàn)代變體極為相似，這表明某些類型ARGs早就存于自然界，而不是現(xiàn)代使用抗生素造成的。外源性耐藥基因主要指ARGs在外在壓力下選擇性遷移到敏感菌中，從而使得敏感菌獲得耐藥性。

1 ARGs多重抗性的形成

ARGs可隨抗性細(xì)菌從糞便進(jìn)入環(huán)境，并通過水平轉(zhuǎn)移機(jī)制（Horizontal gene transfer，HGT）進(jìn)入各種環(huán)境土著菌，其擴(kuò)散效率可能超過親代菌株［3］；同時(shí)，攜帶ARGs的裸露DNA可在菌株死亡后釋放進(jìn)入環(huán)境中且長期存在。畜禽養(yǎng)殖因?yàn)楫a(chǎn)業(yè)的特殊性，抗生素的大量使用不可避免，因此也極大地刺激了ARGs的發(fā)展，給予了ARGs發(fā)展的外在選擇壓力。同時(shí)，因?yàn)樾笄蒺B(yǎng)殖人員關(guān)于抗生素污染的意識單薄和畜禽糞便處理措施匱乏，大部分畜禽糞便未經(jīng)處理或者只經(jīng)過簡單處理就進(jìn)入環(huán)境，尤其是土壤環(huán)境；動(dòng)物腸道內(nèi)和糞便中含有豐富的抗性細(xì)菌和ARGs，因此進(jìn)入農(nóng)田土壤、水源、地下水等周邊環(huán)境，極大地增加了周邊環(huán)境的ARGs豐度及土著耐藥菌的產(chǎn)生。未經(jīng)處理的畜禽糞便大量輸入環(huán)境，對環(huán)境中細(xì)菌的耐藥水平起到了重要的作用，其可誘導(dǎo)多重耐藥基因在細(xì)菌中組合，細(xì)菌呈多重耐藥性。目前，細(xì)菌多重耐藥現(xiàn)象已引起各方日益關(guān)注。典型的多重耐藥致病菌包括：泛耐藥鮑氏不動(dòng)桿菌（Pandrugresistant Acinetobacter baumannii，PRAB）、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）、碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌（Carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa，CRPA）、攜NDM-1（New Delhi metallo-β-lactamase-1）耐藥基因菌、質(zhì)粒介導(dǎo)的黏菌素耐藥基因mcr-1等［4］。細(xì)菌中的多重耐藥基因常以耐藥基因盒或基因島的方式存在。中國學(xué)者發(fā)現(xiàn)，豬源 Escherichia coli的Ⅰ型整合子上 aadA1、blaP1a-aadA2-ereA、aadA2、dfrA1-aacA4-catB3、aadA23B、dfrA1-orfC和dfrA1-aadA1等耐藥基因均存在于耐藥基因島上［5］。Neyra 等［6］研究發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌對甲氧西林的耐藥率14.3%，其多重耐藥率37.1%。

2 ARGs分類

根據(jù)抗生素抑菌機(jī)制的不同可以將抗生素分為β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、氨基糖苷類、磺胺類、糖肽類、喹諾酮類、氯霉素類、大環(huán)內(nèi)脂類等大類，ARGs也可以根據(jù)抗生素類別的不同進(jìn)行分類，其分類情況詳見表1。

表1 不同抗生素類別耐藥基因

3 ARGs研究進(jìn)展

ARGs的形成與傳播，是細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的內(nèi)在因素。隨著科技的發(fā)展和研究手段的不斷優(yōu)化，人們對細(xì)菌染色體和基因組的研究越發(fā)深入，各種ARGs不斷被發(fā)現(xiàn)，使人們對細(xì)菌耐藥性的形成機(jī)制也有了新的認(rèn)識。因ARGs傳播和調(diào)控過程在細(xì)菌基因組內(nèi)的復(fù)雜性，借由對ARGs的研究，對細(xì)菌基因組的研究也得以拓展和深入，而細(xì)菌基因組研究也會大大促進(jìn)了ARGs的研究進(jìn)程。

3.1 傳統(tǒng)ARGs的研究方法

傳統(tǒng)ARGs的研究方法主要為微生物培養(yǎng)鑒定方法，其主要步驟為：①目的樣品采集；②對目的樣品中細(xì)菌進(jìn)行分離純化鑒定，常采用適應(yīng)不同細(xì)菌生長的培養(yǎng)基進(jìn)行菌株分離純化，以生化鑒定方法或者16S rRNA方法對菌株進(jìn)行種群鑒定，以盡量獲取培養(yǎng)菌株信息；③對分離細(xì)菌進(jìn)行抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)，以獲取菌株耐藥表型，抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)經(jīng)常測定菌株的藥物最低抑菌濃度（Minimal inhibitory concentration，MIC），通過MIC判定菌株的耐藥表型。得益于生物技術(shù)的飛速發(fā)展，ARGs的研究方法也取得了巨大進(jìn)步。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）是一種能夠根據(jù)已知目的基因進(jìn)行保守序列的引物設(shè)計(jì)，并以DNA合成基本原料，經(jīng)變性、退火、延伸過程在生物體外快速擴(kuò)增特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)。但是，常規(guī)PCR擴(kuò)增方法具有較大缺點(diǎn)，其只能定性檢測耐藥基因存在與否。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time quantitative PCR，RTQ-PCR）應(yīng)運(yùn)而生，有效解決了常規(guī)PCR擴(kuò)增方法只能定性檢測基因的問題。該方法通過在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，以積累的熒光信號的量來實(shí)時(shí)對PCR進(jìn)程進(jìn)行監(jiān)測，最后與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比進(jìn)行耐藥基因豐度的檢測。但是，普通PCR和RTQ-PCR均局限于已知序列耐藥基因檢測，其不能用于新基因的發(fā)現(xiàn)；且如需進(jìn)行大量基因檢測時(shí)具有較大的工作量。Popowska等［7］采用定量PCR研究了農(nóng)業(yè)土壤中四環(huán)素類、氨基糖苷類類和大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因的分布特征。

3.2 基因芯片檢測技術(shù)

20世紀(jì)80年代末發(fā)展起來的基因芯片技術(shù)克服了PCR方法樣品檢測量小的缺點(diǎn)，其采用集約化和平面處理，在固相載體上固定了數(shù)以百萬計(jì)的DNA探針，通過將樣品與芯片探針雜交來檢測樣品中DNA序列。該方法適用于大量樣品的檢測并具有減小工作量和降低用時(shí)的特點(diǎn)?；蛐酒夹g(shù)主要從兩方面實(shí)現(xiàn)耐藥基因的檢測：①借助寡核苷酸芯片檢測基因組序列的亞型或突變位點(diǎn)；②以基因表達(dá)譜芯片檢測藥物誘導(dǎo)基因表達(dá)的改變［8］。Bruant等［9］設(shè)計(jì)了檢測大腸桿菌毒力基因和耐藥基因的基因芯片，其可檢測致病菌株及其耐藥基因。基因芯片可用于研究環(huán)境微生物的群落結(jié)構(gòu)、代謝途徑、追蹤關(guān)鍵基因等方面。但是基因芯片也有一系列問題需要解決，如：費(fèi)用過高，不合適普通臨床檢測；基因序列庫尚小，需加強(qiáng)建庫工作；基因芯片專利限制，不同公司專利權(quán)不同，需加強(qiáng)行業(yè)信息整合。

3.3 宏基因檢測方法

微生物純化培養(yǎng)方法對于研究細(xì)菌的耐藥性起到了重要作用，但傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法具有一定的局限性。澳大利亞學(xué)者Heinrich Winterberg首先觀察到細(xì)胞計(jì)數(shù)方法和平板計(jì)數(shù)方法得到的樣品中微生物總量存在巨大差異，因?yàn)榇嬖谟诃h(huán)境中的微生物絕大部分是不可培養(yǎng)的，傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法能培養(yǎng)的微生物僅占環(huán)境中微生物總量不到1%，環(huán)境中尚有大量的耐藥微生物被遺漏。

Pace于1985年第一次提出可以從環(huán)境中直接提取DNA來研究不可培養(yǎng)微生物的理念。1995年，Healy等對宏基因文庫成功地進(jìn)行了功能篩選，這為后續(xù)概念提出和實(shí)驗(yàn)完善提供了基礎(chǔ)。1998年，Handelsman等［10］正式提出了宏基因組學(xué)（Metageomics）的概念，即從環(huán)境中提取總DNA中用于進(jìn)行遺傳組成和功能研究。宏基因組學(xué)研究的發(fā)展跨越了傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)研究的瓶頸，讓人們重新認(rèn)識了環(huán)境中微生物群落的多樣性，極大地拓展了微生物學(xué)研究的思路和方法。宏基因組學(xué)研究微生物的主要方法包括3個(gè)過程：①環(huán)境樣品總DNA提取。DNA提取過程需根據(jù)樣品的不同特點(diǎn)選擇不同的提取方法，而不同的提取方法得到的提取結(jié)果也會有所差異，這也直接影響了后續(xù)試驗(yàn)［11］。②建立宏基因文庫并測序。測序時(shí)可通過不同專用平臺進(jìn)行測序，但不同測序平臺得到的最終結(jié)果有所差異，目前常用的測序平臺有Illumina MiSeq和Illumina HiSeq平臺。③序列拼接與分析。理論上選擇合適的樣品總DNA提取方法并測得一定的測序深度后獲得的信息能夠全面反映樣品的遺傳信息，獲得微生物全基因組信息。宏基因組學(xué)主要分為功能宏基因組學(xué)和序列宏基因組學(xué)?？梢詫⑽粗退幓虻蔫b定歸為功能宏基因組學(xué)方向。目前，宏基因測序在環(huán)境菌群分析、腸道菌群分析、耐藥基因檢測鑒定方面發(fā)揮了重要作用。耐藥基因相關(guān)比對數(shù)據(jù)庫有：SEED database“Resistance to antibiotics and toxic compounds”、Antibiotic Resistance Genes Database（http：//ardb.cbcb.umd.edu/）和 MetaGeneMark。

基于測序技術(shù)的飛速發(fā)展，尤其是二代測序應(yīng)用以來，宏基因組方法在環(huán)境細(xì)菌耐藥性上的應(yīng)用研究得到了充分體現(xiàn)［12］。Chambers 等［13］通過宏基因組學(xué)測序方法發(fā)現(xiàn)，奶牛糞便中的β-內(nèi)酰胺類耐藥基因因?yàn)轭^孢類抗生素的使用而得到富集。有學(xué)者通過大量宏基因測序數(shù)據(jù)來比較分析不同來源ARGs的組成，確定了目前已知大部分ARGs在不同環(huán)境的分布規(guī)律［14］。Fang等［15］發(fā)現(xiàn)，蔬菜地土壤施用雞糞后能使耐藥菌和耐藥基因富集，其檢測到22大類ARGs和46種攜帶耐藥基因的潛在致病菌。

3.4 微生物單細(xì)胞基因組技術(shù)

微生物單細(xì)胞基因組學(xué)是在宏基因組學(xué)后發(fā)展起來的能夠有效獲取無法人工培養(yǎng)微生物基因信息的新技術(shù)［16］。目前，環(huán)境微生物研究中主要將其應(yīng)用于探索未被常規(guī)技術(shù)或宏基因組技術(shù)探測到的功能基因、發(fā)現(xiàn)豐度極小的未培養(yǎng)微生物或者研究微生物細(xì)胞生命進(jìn)化過程等［17］。微生物單細(xì)胞基因組技術(shù)包括單細(xì)胞獲取、全基因組擴(kuò)增、全基因組測序以及數(shù)據(jù)分析等步驟。微生物單細(xì)胞獲取常用的方法主要有：有限稀釋、流式細(xì)胞分選、光鑷抓取、顯微操作和微流控芯片等，各種方法均有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，具體使用時(shí)需按實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇。單個(gè)微生物細(xì)胞內(nèi)含有很少量的DNA，需要使用特殊擴(kuò)增方式將單細(xì)胞基因組從飛克級別擴(kuò)增到納克至微克級別才可用于后續(xù)分析［18］。Rinke 等［19］對 9 600 個(gè)環(huán)境微生物單細(xì)胞進(jìn)行全基因組擴(kuò)增和部分細(xì)胞測序，獲得了201個(gè)未培養(yǎng)的細(xì)菌細(xì)胞及古菌，揭示了微生物之間的生物關(guān)系及其潛在代謝能力，并發(fā)現(xiàn)了新的嘌呤合成途徑。微生物單細(xì)胞基因組技術(shù)在探測新型微生物或基因方面具有巨大的潛力，但是因?yàn)榧夹g(shù)發(fā)展原因，該技術(shù)使用成本高昂，不適用于常規(guī)檢測。

3.5 ARGs消除方法

目前，抗生素濫用導(dǎo)致的環(huán)境耐藥菌增多，ARGs的轉(zhuǎn)移已經(jīng)成為不爭的事實(shí)，由此所引發(fā)的生態(tài)環(huán)境問題和人員健康問題也不斷得到人們關(guān)注。作為一個(gè)農(nóng)業(yè)大國，我國畜禽產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展，畜禽糞便產(chǎn)量連創(chuàng)新高，隨糞便排出的抗生素量和由此誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗性基因?qū)Νh(huán)境造成的污染也越來越嚴(yán)重。為了降低環(huán)境中抗生素殘留水平以及遏制抗性基因的傳播擴(kuò)散，必須采取有力措施，防止抗生素和抗性基因污染的進(jìn)一步蔓延和惡化。3.5.1抗生素降解方法 抗生素自發(fā)現(xiàn)以來對控制人類疾病發(fā)揮了重要的作用，其同時(shí)也被用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)，為人類畜產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展做出了巨大貢獻(xiàn)。然而，抗生素在全球范圍內(nèi)的濫用情況也十分嚴(yán)重，同時(shí)因其只有少量部分能被機(jī)體吸收，大部分通過代謝途徑排出體外進(jìn)入環(huán)境，由此引發(fā)的一系列環(huán)境問題及最終的對人類健康的影響問題也越來越受到人們的關(guān)注。加強(qiáng)抗生素降解方式的研究迫在眉睫。

自然環(huán)境是抗生素的受納體，同時(shí)也是抗生素降解的促進(jìn)體，但不同環(huán)境對于抗生素的降解作用有所不同［20］。光照是促進(jìn)抗生素降解作用的重要因素。有研究表明，充足光照條件下，3 h內(nèi)四環(huán)素、紅霉素和土霉素的降解率分別可以達(dá)到66.87%、92.80%和90.55%［21］。有些抗生素本身為水溶性，極易溶于水，這在一定條件下也促進(jìn)了抗生素的水解。在適宜條件（25℃，pH=7）下，青霉素、頭孢西丁和頭孢噻吩的半衰期在5.3～27 d范圍內(nèi)［22］。微生物降解也是去除環(huán)境中殘留抗生素的有效方式，如添加選擇性有益降解菌劑對于去除四環(huán)素類抗生素殘留有很大效果［23］。堆肥處理是一種去除畜禽糞便中抗生素的有效手段。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，堆肥處理能夠去除糞便中殘留抗生素的50%～70%［24］。堆肥處理過程中處理好溫度和氧氣條件有利于更好地去除糞便中抗生素殘留［25］。Arikan 等［26］發(fā)現(xiàn)，55℃條件下堆肥處理能夠去除99%的金霉素，但是無溫控堆肥僅有49%的去除率。

3.5.2 ARGs去除方法 ARGs去除與抗生素降解過程有一定相似之處，光照、溫度和微生物群落結(jié)構(gòu)等均可以影響ARGs的去除。有研究表明，ARGs降解過程可以因?yàn)楣庹窄h(huán)境而加速［27］。ARGs存在于微生物細(xì)胞內(nèi)，不同微生物對于ARGs具有一定的耐受性，因此微生物群落的組成能夠在一定程度上影響ARGs的含量，微生物菌群類型能夠促使ARGs發(fā)生變化［28］。厭氧消化和好氧堆肥是畜禽糞便處理的主要工藝，這兩種方式均對ARGs的去除具有良好的效果。Cheng等［29］對養(yǎng)豬場內(nèi)不同工藝處理的廢水進(jìn)行了ARGs去除情況研究，發(fā)現(xiàn)厭氧消化處理能夠降低大部分ARGs含量，但其他處理方法影響不大。利用堆肥過程產(chǎn)生的高溫，可有效去除耐藥質(zhì)粒和 ARGs含量［30］。鄭寧國等［31］研究了高溫堆肥對豬糞來源ARGs的影響，結(jié)果表明，高溫堆肥對β-內(nèi)酰胺類ARGs和喹諾酮類ARGs具有一定去除能力，但大環(huán)內(nèi)酯類ARGs去除效果不明顯。

4 結(jié)語

抗生素濫用造成的環(huán)境污染問題及ARGs在菌群之間的轉(zhuǎn)移引起的生態(tài)問題已引起各國學(xué)者和民眾的高度關(guān)注。但環(huán)境中抗生素和ARGs的產(chǎn)生與存留是長期積累的過程，且在短期內(nèi)不會消失。研究抗生素和ARGs的分布和行為特征等對人類采取合理對策減輕環(huán)境污染具有十分重要的意義。目前該領(lǐng)域的研究方向主要集中在對環(huán)境中抗生素和ARGs的監(jiān)測，對于環(huán)境中ARGs存留及其影響因素、傳遞機(jī)制及其影響因素、遷移轉(zhuǎn)化、人工去除等方面研究較少，未來針對ARGs研究建議從ARGs來源、傳遞機(jī)制、環(huán)境消除規(guī)律、遷移規(guī)律等方面進(jìn)行。

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