丁玉春，林 玲，羅 林，張成剛，吳 夢

（重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460）

山羊痘是由山羊痘病毒引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，病原為痘病毒科、脊椎動(dòng)物痘病毒亞科、山羊痘病毒屬，是一種大型病毒［1-3］。山羊痘又稱“羊天花”，可感染多個(gè)年齡段、不同品種的山羊，多發(fā)于羔羊，無明顯季節(jié)性，但冬末春初最易流行［4］。感染該病毒后羊只多見全身性的丘疹、結(jié)節(jié)或水泡，并伴隨內(nèi)臟性病變，嚴(yán)重者出現(xiàn)死亡，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失［5-6］。整個(gè)病程經(jīng)丘疹、水泡和結(jié)痂一般可持續(xù)3～4周，病羊痊愈后可以獲得終身免疫［7］。山羊痘對宿主具有一定的特異性，自然感染多發(fā)生于山羊，其特異性與毒株自身特性密切相關(guān)，僅有少量毒株使綿羊發(fā)病，偶爾感染人［8-9］。

目前，羊痘疫苗多為弱毒苗，由于國內(nèi)疫苗產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，弱毒苗常出現(xiàn)返強(qiáng)，導(dǎo)致羊只發(fā)病，嚴(yán)重者造成疫病的流行［10-13］。并且，山羊痘病毒地區(qū)差異性較大，疫苗產(chǎn)品在不同地區(qū)的應(yīng)用效果各有差異［11］，因此，對山羊痘病毒新毒株的研究十分必要，尤其對地方毒株的研究更加重要。筆者等對重慶地區(qū)山羊痘病毒進(jìn)行了分離鑒定，并構(gòu)建了動(dòng)物模型，為羊痘致病機(jī)理的研究奠定了基礎(chǔ)，也為羊痘疫苗新產(chǎn)品的研發(fā)提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

病毒DNA提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒、DL 2000 DNA Marker、2×Taq PCR Master Mix 均 購 自Solarbio公司；依據(jù)NCBI中公布的山羊痘病毒P32基因設(shè)計(jì)特異性引物F1/F2，序列由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列信息見表1。

表1 引物序列信息

1.2 病料及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

病料及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均由重慶市榮昌區(qū)某羊場提供。

1.3 方法

1.3.1 病料的處理 對疑似山羊痘感染羊只進(jìn)行臨床診斷，采集病變部位丘疹或痂皮，按1∶5的比例加入含有雙抗的PBS溶液，用研缽研磨，收集研磨液，反復(fù)凍融3次后，3 000 r/min離心30 min，將上清經(jīng)0.45 μm濾器過濾，收集濾液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 P32基因序列PCR鑒定及測序分析 參照病毒DNA提取試劑盒說明書，提取1.3.1中收集的樣本DNA。利用特異性引物F1/F2進(jìn)行羊痘病毒P32基因序列的PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，引物 F1/F2各 0.5 μL，模板 5 μL，ddH2O 19 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min；95℃變性45 s，58℃退火 45 s，72℃延伸 45 s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA膠回收試劑盒回收后，送往生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序分析。

1.3.3 遺傳進(jìn)化分析 將測序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行BLAST比對，分析其與羊痘病毒P32基因的同源性，利用N-J法將分離株序列與其相關(guān)性較好的序列進(jìn)行比對，借助MEGA5.軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹。

1.3.4 病毒的純化培養(yǎng)

1.3.4.1 病毒細(xì)胞培養(yǎng) 將鑒定為陽性的病料研磨液接種單層BHK21細(xì)胞，接毒量與維持液的比例為1∶10，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察記錄細(xì)胞病變情況。若細(xì)胞在接種病料后5 d內(nèi)未出現(xiàn)病變則連續(xù)盲傳3代，若第5代仍未出現(xiàn)病變則視為陰性，出現(xiàn)病變的反復(fù)凍融3次后收毒，置-80℃保存。

1.3.4.2 病毒TCID50測定 將BHK21在96孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞長成單層時(shí)，將病毒液按照10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10濃度連續(xù) 10 倍稀釋后，接種于96孔板細(xì)胞培養(yǎng)板，每一稀釋濃度接種一列，第11、12列作為細(xì)胞空白對照，每孔接種100 μL，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞產(chǎn)生病變孔數(shù)，記錄結(jié)果，根據(jù)Reed-Muench氏法計(jì)算病毒TCID50值。

1.3.5 動(dòng)物模型的構(gòu)建 選取未免疫山羊痘疫苗的3月齡健康羔羊2只，用皮下劃痕和多點(diǎn)皮內(nèi)注射法，將山羊痘病毒接種健康羔羊1只，接種量為0.5 mL，另外1只羔羊接種生理鹽水作為對照組，均正常飼喂，逐日觀察記錄羔羊發(fā)病情況，同時(shí)記錄羔羊體重、體溫（直腸溫度）變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 山羊痘病毒PCR鑒定及測序結(jié)果

PCR鑒定結(jié)果表明，在約800 bp的位置出現(xiàn)特異性條帶（見圖 1），經(jīng)測序，其大小為 815 bp（見圖 2），與預(yù)期結(jié)果一致。

圖1 山羊痘病毒P32基因PCR鑒定結(jié)果

2.2 進(jìn)化樹

將所得基因序列在NCBI中進(jìn)行BLAST比對后，發(fā)現(xiàn)其與山羊痘病毒（登錄號AY881707.1）P32基因序列同源性最高（99%），在系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹中也與其聚為一簇。結(jié)果見圖3。

圖2 山羊痘病毒P32基因測序結(jié)果

圖3 基于山羊痘病毒P32基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹（Isolate strain為分離株序列）

2.3 山羊痘病毒細(xì)胞培養(yǎng)

病毒接種BHK21細(xì)胞盲傳至F4代時(shí)，細(xì)胞開始出現(xiàn)病變，培養(yǎng)至48 h時(shí)，細(xì)胞出現(xiàn)拉絲結(jié)網(wǎng)、固縮變圓和脫落的現(xiàn)象，72 h時(shí)出現(xiàn)空斑，結(jié)果見圖4～6。對穩(wěn)定傳代的病毒進(jìn)行TCID50檢測，結(jié)果為1×10-4.5/mL。

圖4 正常BHK21細(xì)胞形態(tài)

圖5 接毒山羊痘病毒48 h BHK21細(xì)胞形態(tài)

圖6 接毒山羊痘病毒72 h BHK21細(xì)胞形態(tài)

2.4 動(dòng)物模型

2.4.1 發(fā)病情況 通過對羔羊人工感染山羊痘病毒發(fā)現(xiàn)，羔羊在接毒10 d后，唇部和尾根部出現(xiàn)紅色丘疹和水泡（見圖7～8），食欲開始減退，精神不振，出現(xiàn)羊痘初期癥狀，第15天形成痂皮，進(jìn)入結(jié)痂期，第28天結(jié)痂開始脫落，第35天時(shí)，羔羊病情好轉(zhuǎn)。整個(gè)病程中，羔羊體重變化差異不大，未出現(xiàn)死亡。

2.4.2 體溫變化 通過對攻毒后羔羊直腸溫度進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，接種部位劃痕在第4天愈合，第7天開始出現(xiàn)體溫升高，第16天達(dá)到最高（42℃），第26天時(shí)體溫趨于正常，體溫變化見圖9。

圖7 人工感染山羊痘病毒羔羊唇部初期癥狀

圖8 人工感染山羊痘病毒羔羊尾根部初期癥狀

圖9 人工感染山羊痘病毒羔羊體溫變化

3 討論

本研究應(yīng)用臨床診斷、分子鑒定、細(xì)胞培養(yǎng)、遺傳進(jìn)化分析和構(gòu)建動(dòng)物模型等方法，分離到一株重慶地區(qū)山羊痘病毒，并對其細(xì)胞培養(yǎng)特性和致病性進(jìn)行了初步研究，結(jié)果表明，分離純化到的山羊痘病毒可以在BHK21細(xì)胞中穩(wěn)定增殖，并出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變，這為該病毒的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。研究表明，不同山羊痘病毒在攻毒家兔、豚鼠和雞胚時(shí)，表現(xiàn)出的癥狀各有差異，僅有部分毒株可以使家兔和豚鼠形成局部痘斑，少數(shù)毒株可以在雞胚尿囊膜上出現(xiàn)典型的痘斑［14-16］，說明不同的山羊痘病毒存在較大差異，也表明本研究的必要性。將山羊痘病毒接種3月齡健康羔羊后，羔羊在攻毒第7天時(shí)，開始出現(xiàn)體溫升高、精神不振等癥狀，在第16天時(shí)體溫達(dá)到42℃；攻毒第10天，羔羊表現(xiàn)出山羊痘的初期癥狀，第35天時(shí)病情好轉(zhuǎn)，整個(gè)病程中，羔羊體重變化差異不大。通過動(dòng)物模型的構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)羔羊未出現(xiàn)皮膚全身性的病理變化，也未出現(xiàn)死亡。目前，關(guān)于山羊痘重慶地區(qū)分離株的報(bào)道相對較少，本研究為山羊痘地方株疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)，也為重慶地區(qū)山羊痘的防控提供了理論依據(jù)。

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