王羚佳WANG Ling-jia 舒曉夢(mèng) - 辛 文 張馳松 - 陳祥貴 - 楊 瀟

(1. 西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610039；2. 成都市農(nóng)林科學(xué)院，四川 成都 611130)

桑葉為?？?Moraceae)植物桑(MorusalbaL.)的葉，目前已被衛(wèi)生部認(rèn)定為藥食兩用植物[1]。已有的研究表明，桑葉多糖具有調(diào)節(jié)人體代謝和清除自由基的功能[2]；其機(jī)制涉及抑制糖代謝相關(guān)酶類及抗氧化[3]。 雅津蛋白桑又稱飼料桑，是中國(guó)培育的新型桑樹(shù)品種，具有區(qū)域適應(yīng)性和抗逆性強(qiáng)、蛋白質(zhì)含量高、產(chǎn)量高等的優(yōu)點(diǎn)，已在中國(guó)多個(gè)地區(qū)大力推廣，開(kāi)發(fā)前景十分廣闊[4]。

目前對(duì)桑葉多糖的研究主要集中于提取方法、多糖成分表征、單一多糖成分的純化和生物活性鑒定[5]。在多種植物多糖提取方法中酶解法操作條件相對(duì)溫和，對(duì)提取物的生物活性損傷小，提取效率高，有較大的實(shí)用價(jià)值[6]。在多糖生物活性研究中也發(fā)現(xiàn)不同分子量的桑葉多糖成分表現(xiàn)出了不同的生物活性[3,7-8]。但從雅津蛋白桑葉中提取多糖作為功能性食品原料使用時(shí)，考慮到生產(chǎn)成本，通常采用總多糖為原料，而對(duì)雅津蛋白桑葉總多糖的酶法提取與純化及其生物活性方面的研究卻無(wú)相關(guān)報(bào)道。本研究利用正交試驗(yàn)優(yōu)化了纖維素酶法提取雅津蛋白桑葉多糖的工藝條件，再采用Sephadex G-100 型葡聚糖凝膠對(duì)多糖進(jìn)行純化，并比較純化前后多糖的生物活性，為以雅津蛋白桑葉為原料的桑葉多糖在食品領(lǐng)域的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

雅津蛋白桑桑葉：成都市農(nóng)林科學(xué)院；

濃硫酸、苯酚、無(wú)水乙醇、三氯乙酸、葡萄糖、抗壞血酸、鐵氰化鉀、三氯化鐵、硫酸亞鐵、磷酸二氫鈉、水楊酸、磷酸氫二鈉、H2O2(30%)、無(wú)水碳酸鈉、蔗糖：分析純，成都市科龍化工試劑廠；

1，1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH)、對(duì)硝基苯-β-D-半乳糖吡喃糖苷(pNPG)：美國(guó)Sigma公司；

纖維素酶、α-葡萄糖苷酶：上海源葉生物科技有限公司；

制備液相色譜儀：AKTA purifier 10型，美國(guó)GE公司；

多功能酶標(biāo)儀：Infinite F500型，瑞士TECAN公司；

電子天平：BSA224型，德國(guó)Sartorius公司。

1.2 桑葉多糖含量的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法[9]。

1.3 纖維素酶法提取桑葉多糖

將新鮮桑葉用蒸餾水沖洗干凈，除去表面雜質(zhì)，凍干粉碎，100目過(guò)篩待用。準(zhǔn)確稱量桑葉粉10.00 g，置于圓底燒瓶中，加入100 mL蒸餾水[料液比1∶10 (g/mL)]，適量纖維素酶，充分震蕩，使其溶解。調(diào)節(jié)pH值，在一定溫度下酶解。并在80 ℃下回流60 min提取多糖。提取液冷卻后抽濾，濾液中加入10 mL三氯乙酸，混勻后4 ℃過(guò)夜以沉淀蛋白。過(guò)濾，濾液于4 ℃、5 000 r/min離心10 min，棄沉淀。取上清液加入4倍體積的無(wú)水乙醇，于4 ℃ 過(guò)夜沉淀多糖。4 ℃、5 000 r/min離心10 min去上清，沉淀于-40 ℃冷凍干燥后待用。

1.3.1 單因素對(duì)纖維素酶法提取多糖得率的影響 根據(jù)文獻(xiàn)[10]，酶解pH、酶解溫度、酶解時(shí)間和酶濃度是影響酶法提取多糖得率的主要因素。為了解各因素變化對(duì)多糖得率的影響，選取酶解pH、酶解溫度、酶解時(shí)間和酶濃度進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

(1) 酶解pH的影響：固定纖維素酶濃度2%、酶解溫度 55 ℃、酶解時(shí)間50 min，分別比較pH為 4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0時(shí)對(duì)多糖得率的影響。

(2) 酶解溫度的影響：固定纖維素酶濃度2%、酶解pH 6.0、酶解時(shí)間50 min，分別比較酶解溫度為45，50，55，60，65 ℃ 時(shí)對(duì)多糖得率的影響。

(3) 酶解時(shí)間的影響：固定纖維素酶濃度2%、酶解pH 6.0、酶解溫度 55 ℃，分別比較酶解時(shí)間為10，20，30，40，50，60，70 min時(shí)對(duì)多糖得率的影響。

(4) 酶濃度的影響：固定酶解時(shí)間50 min、酶解pH 6.0、酶解溫度 55 ℃，分別比較纖維素酶濃度為0.0%，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%，3.5%，4.0%時(shí)對(duì)多糖得率的影響。

1.3.2 正交優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取pH、溫度、酶濃度和酶反應(yīng)時(shí)間四因素的最優(yōu)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，對(duì)酶法提取桑葉多糖的工藝條件進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

1.4 桑葉多糖的純化

參考應(yīng)芝等[11]的研究，選用 Sephadex G-100 型葡聚糖凝膠為填料，以蒸餾水為流動(dòng)相。準(zhǔn)確稱取100 mg桑葉粗多糖溶于5 mL蒸餾水。將樣品溶液上柱，以流速為2 mL/min 洗脫，每管收集5 mL洗脫液。每管取100 μL用苯酚-硫酸法在490 nm處測(cè)定吸光度。根據(jù)每管洗脫液的多糖含量繪制洗脫曲線，合并同一洗脫峰的洗脫液，經(jīng)截留分子量為3 000 Da 的超濾離心管，4 ℃、7 000 r/min離心30 min 濃縮，收集濃縮液于-40 ℃冷凍干燥后待用。

1.5 桑葉多糖總抗氧化能力的測(cè)定

參考Benjakul等[12]的方法(普魯士藍(lán)法)并修改如下：取1 mL不同濃度(0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL )桑葉總多糖溶液，依次加入2.5 mL磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/mL，pH 6.6)，2.5 mL 鐵氰化鉀溶液 (1 g/mL)混勻，于50 ℃下孵育20 min，冷卻后加入2.5 mL 三氯乙酸溶液(10 g/100 mL)混勻，從中取出 2.5 mL再加入 2.5 mL蒸餾水和 0.5 mL三氯化鐵溶液 (1 mg/mL)，常溫下反應(yīng) 20 min后于波長(zhǎng)700 nm處測(cè)定吸光度值，多糖的總抗氧化能力與吸光度值正相關(guān)。

1.6 桑葉多糖對(duì)DPPH 自由基的清除能力

為比較純化前后桑葉總多糖對(duì)DPPH 自由基的清除能力，根據(jù)文獻(xiàn)[13]修改如下：分別取2 mL 不同濃度(0.05，0.10，0.15，0.20，0.25 mg/mL)的桑葉總多糖溶液，加入2 mL DPPH-乙醇溶液 (0.1 mmol/L)混勻，室溫下避光孵育 30 min，并于517 nm處測(cè)定吸光度值。根據(jù)式(1)計(jì)算DPPH自由基清除率。

(1)

式中：

d——DPPH清除率，%；

Ai——測(cè)定樣品的吸光度值；

Aj——采用乙醇替換DPPH-乙醇溶液時(shí)樣品的吸光度值；

A0——樣品被蒸餾水代替時(shí)測(cè)定的吸光度值。

根據(jù)清除率，并參照馮艷萍等[14]報(bào)道的方法計(jì)算半抑制濃度(IC50值)。

1.7 桑葉多糖對(duì)羥自由基(·OH)的清除能力

參考Feton反應(yīng)的方法[15]修改如下：取0.5 mL濃度分別為0.40，0.80，1.20，1.60，2.00 mg/mL的桑葉總多糖溶液，再加入1 mL硫酸亞鐵溶液(6 mmol/L)， 1 mL水楊酸-乙醇溶液(6 mmol/L)，1 mL 過(guò)氧化氫溶液(8.8 mmol/L)和1 mL 蒸餾水，混勻，于37 ℃下孵育30 min，測(cè)定波長(zhǎng)510 nm處的吸光度值。根據(jù)式(2)計(jì)算羥自由基(·OH)清除率。

(2)

式中：

d——羥自由基清除率，%；

Ai——樣品測(cè)定的吸光度值；

Aj——以蒸餾水代替過(guò)氧化氫溶液時(shí)測(cè)定的吸光度值；

A0——以蒸餾水代替樣品時(shí)測(cè)定的吸光度值。

根據(jù)清除率，并參照馮艷萍等[18]報(bào)道的方法計(jì)算IC50值。

1.8 桑葉多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用

參考Masao Hattori等[16]方法并修改如下：移取50 μL不同濃度 (0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mg/mL)的桑葉總多糖溶液于酶標(biāo)板中，依次加入 850 μL磷酸鹽緩沖液(0.1 mmol/L，pH 5.0)，50 μLα-葡萄糖苷酶溶液(100 U/mL)，50 μL pNPG溶液(0.011 6 mol/L)混勻。 于37 ℃下恒溫孵育10 min 后，再加入4 mL碳酸鈉溶液(0.1 mol/L)以終止反應(yīng)，并測(cè)定波長(zhǎng)400 nm處的吸光度值。根據(jù)式(3)計(jì)算桑葉總多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率。

(3)

式中：

h——α-葡萄糖苷酶抑制率，%；

Ai——樣品測(cè)定的吸光度值；

Aj——以磷酸鹽緩沖液代替α-葡萄糖苷酶溶液時(shí)測(cè)定的吸光度值；

A0——以磷酸鹽緩沖液代替樣品時(shí)測(cè)定的吸光度值。

根據(jù)抑制率，并參照馮艷萍等[18]報(bào)道的方法計(jì)算IC50值。

1.9 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均以3個(gè)獨(dú)立樣本(n=3)的x±SEM表示。采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析后，使用Student's t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組之間的比較，或者使用進(jìn)行Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素酶法提取單因素試驗(yàn)

2.1.1 pH的影響 由圖1可知，當(dāng)pH<6.0時(shí)，多糖得率隨pH增加而顯著增大，并在pH為6.0時(shí)達(dá)到最大值。但隨著pH值的繼續(xù)增加，得率呈下降趨勢(shì)。 pH對(duì)多糖得率的影響呈單峰函數(shù)，可能是由于過(guò)高或過(guò)低的pH 值會(huì)影響酶的活性，在低pH時(shí)，過(guò)量的酸會(huì)水解多糖的糖苷鍵而引起多糖結(jié)構(gòu)破壞，而過(guò)高的pH會(huì)破壞酶的空間結(jié)構(gòu)，影響底物結(jié)合效率。當(dāng)pH 值在6.0時(shí)酶活較強(qiáng)，使得植物細(xì)胞壁能夠迅速降解，多糖更易溶出。

2.1.2 酶解溫度的影響 由圖2可知，當(dāng)酶解溫度低于55 ℃ 時(shí)，多糖得率隨溫度的升高而顯著增加，并于55 ℃ 時(shí)達(dá)到最大。此后隨著溫度的升高，得率呈下降趨勢(shì)。酶解溫度對(duì)多糖得率的影響呈單峰函數(shù)，可能是由于溫度升高時(shí)酶促反應(yīng)加速，但當(dāng)溫度超過(guò)酶的最適溫度時(shí)，造成酶活力降低，從而使得率下降。

不同字母表示各組差異顯著，P<0.05圖1 pH對(duì)多糖得率的影響Figure 1 Effect of pH on the yield of polysaccharides

不同字母表示各組差異顯著，P<0.05圖2 酶解溫度對(duì)多糖得率的影響Figure 2 Effect of temperature on the yield of polysaccharides

2.1.3 酶濃度的影響 由圖3可知，當(dāng)酶濃度低于2 mg/mL 時(shí)，多糖得率隨著酶濃度的增加而顯著增加，而酶濃度超過(guò)2 mg/mL后，多糖得率再無(wú)顯著變化。這可能是由于隨著酶量的增加，酶與底物接觸機(jī)率增大，使得多糖更快地溶出。而當(dāng)酶濃度升高到一定程度時(shí)，酶促反應(yīng)達(dá)到飽和，使得多糖的得率不再增加。

不同字母表示各組差異顯著，P<0.05圖3 酶濃度對(duì)多糖得率的影響Figure 3 Effect of enzyme concentration on the yield of polysaccharides

2.1.4 酶解時(shí)間的影響 由圖4可知，在多糖提取的初期多糖得率隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著提高，酶解時(shí)間的延長(zhǎng)有助于細(xì)胞壁的溶解和多糖的溶出。當(dāng)酶解時(shí)間為50 min時(shí)，多糖得率達(dá)到最大。此后隨著酶解時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，多糖得率反而顯著下降。這可能是由于已溶出的多糖在反應(yīng)體系中發(fā)生了破壞和降解。

2.2 纖維素酶法提取正交試驗(yàn)

L9(34)正交試驗(yàn)因素水平取值見(jiàn)表1，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，影響多糖得率的因素主次關(guān)系為：pH>酶解溫度>酶濃度>酶解時(shí)間，最優(yōu)的組合方式為A2B2C1D3，即：pH 6.0，酶解溫度60 ℃，酶濃度1.0%，酶解時(shí)間50 min。采用最優(yōu)組合進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(n=3)，所得多糖得率為(7.608±0.043)%，說(shuō)明在最優(yōu)組合下具有較高的多糖得率。

不同字母表示各組差異顯著，P<0.05圖4 酶解時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Figure 4 Effect of enzymolysis time on the yield of polysaccharides

表1 酶法提取多糖正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors level of enzymatic extraction polysaccharide orthogonal test

表2 L9(34)正交試驗(yàn)Table 2 L9(34)orthogonal experiment

2.3 桑葉多糖的純化

由圖5可知，洗脫曲線只有一個(gè)較大吸收峰，將該吸收峰下糖含量較高的第15～30管洗脫液合并，超濾濃縮并凍干后，即得純化的桑葉總多糖樣品。

雖然通過(guò)該方法只能對(duì)粗多糖進(jìn)行純化，并不能將粗多糖中各個(gè)組分分離。不過(guò)作為食品原料并不需要高純度的單一種類多糖，且該方法簡(jiǎn)單快速，不僅多糖的回收率大于80%，同時(shí)也能有效地除去色素、蛋白等雜質(zhì)。

圖5 桑葉多糖凝膠過(guò)濾洗脫曲線Figure 5 Gel filtration elution curves of total polysaccharide

2.4 桑葉多糖抗氧化活性比較

通過(guò)總抗氧化能力、DPPH 自由基(DPPH·)清除能力和羥自由基(·OH) 清除能力試驗(yàn)，對(duì)純化前后桑葉多糖的抗氧化活性進(jìn)行比較，從圖6可知，桑葉總多糖在純化前后均具有總抗氧化能力、DPPH·和·OH清除能力，且都與其濃度呈正相關(guān)，具有顯著的劑量依賴效應(yīng)。這可能是由于多糖的抗氧化能力是通過(guò)自身氧化提供電子從而實(shí)現(xiàn)自由基的清除[17]，多糖濃度越高，所提供的電子數(shù)量越多，其抗氧化能力越強(qiáng)。

而在相同濃度下，經(jīng)純化的桑葉總多糖的總抗氧化能力、DPPH·和·OH清除能力均顯著高于未經(jīng)純化的(P<0.01)。純化前后桑葉多糖對(duì)DPPH自由基清除能力的IC50值分別為 0.54，0.11 mg/mL，純化后提升了約5倍，對(duì)·OH清除能力的IC50值分別為24.48，8.19 mg/mL，純化后約為純化前的3倍。由于多糖純度越高其抗氧化活性越強(qiáng)，表明多糖成分在雅津蛋白桑葉抗氧化功能中發(fā)揮著主要作用。

2.5 桑葉多糖抑制α-葡萄糖苷酶活性比較

比較純化前后桑葉多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率發(fā)現(xiàn)，純化前后桑葉多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶均有明顯的抑制作用，且濃度越大，抑制率越高，呈劑量依賴效應(yīng)(圖7)，與季濤等[18]的研究一致。但在相同濃度下，經(jīng)純化的桑葉總多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率反而顯著低于未經(jīng)純化的(P<0.01)。通過(guò)計(jì)算可知純化前后兩者的IC50值分別為 2.70，4.84 mg/mL，純化后其抑制率僅為純化前的0.56倍。

由于桑葉具有顯著的降血糖功能[19]，而α-葡萄糖苷酶作為碳水化合物代謝的關(guān)鍵酶[20]，一直是桑葉中降糖功能成分的重要靶點(diǎn)之一[21-22]。已有研究[22]發(fā)現(xiàn)桑葉中的黃酮、生物堿類物質(zhì)也具有抑制α-葡萄糖苷酶的作用，特別是其中的多羥基生物堿1-脫氧野尻霉素(DNJ)已被證明是桑葉降血糖的主要活性成分，具有極強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制活性。而純化后的雅津蛋白桑葉多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率反而顯著低于未經(jīng)純化的，暗示了純化前的雅津蛋白桑葉粗多糖中可能含有黃酮、生物堿等其它具有更強(qiáng)α-葡萄糖苷酶抑制活性雜質(zhì)，也表明雖然雅津蛋白桑葉總多糖也具有一定的α-葡萄糖苷酶抑制能力，但卻不是雅津蛋白桑葉中發(fā)揮α-葡萄糖苷酶抑制能力的主要成分。

3 結(jié)論

采用纖維素酶法提取雅津蛋白桑葉總多糖的最佳工藝條件為：pH 6.0，酶解溫度60 ℃，酶濃度1.0%，酶解時(shí)間50 min，在此條件下桑葉多糖的得率可達(dá)(7.608±0.043)%。選用 Sephadex G-100型葡聚糖凝膠為填料，以蒸餾水為流動(dòng)相，進(jìn)行凝膠層析，以截留分子量3 000 Da的超濾管進(jìn)行濃縮，可以對(duì)雅津蛋白桑葉粗多糖進(jìn)行純化，滿足其作為功能性食品原料的生產(chǎn)工藝要求。

**表示與純化前相比差異顯著，P<0.01圖6 純化前后桑葉多糖的抗氧化能力Figure 6 Antioxidant capacity of different purity total polysaccharides

**表示與純化后相比差異顯著，P<0.01圖7 純化前后桑葉多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制能力

Figure 7α-glucosidase inhibition rate of different purity mulberry (MorusalbaL.) leavestotal polysaccharides

經(jīng)過(guò)純化的雅津蛋白桑葉總多糖在總抗氧化能力、DPPH·和·OH清除率方面，均顯著高于未經(jīng)純化的，表明在桑葉中發(fā)揮抗氧化功能的主要成分為多糖。而經(jīng)過(guò)純化的桑葉總多糖對(duì)a-葡萄糖苷酶的抑制能力要弱于未經(jīng)純化的，表明多糖并非雅津蛋白桑葉中發(fā)揮a-葡萄糖苷酶抑制功能的主要成分。

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