徐 穎XU Ying 李 潔 賀丹丹 - 呂嘉櫪 -

(陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安 710021)

近年來(lái)，重金屬污染引起的食品安全問(wèn)題已成為人們廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)，食品中重金屬主要來(lái)源于工業(yè)“三廢”和生活垃圾等污染，受污染食品主要包括糧食、果蔬和水產(chǎn)品等。2013年，中國(guó)受重金屬污染的耕地面積近2.0×107hm2，約占耕地總面積的20%，被重金屬污染的糧食多達(dá)1.20×107t，合計(jì)損失至少200億元[1]，解決重金屬污染的問(wèn)題非常迫切。但重金屬污染具有分布范圍廣、不可降解、治理難度大、危害程度深等特點(diǎn)，傳統(tǒng)去除方法主要有物理和化學(xué)修復(fù)法，包括反滲透法、萃取法、活性炭吸附法、過(guò)濾法、化學(xué)沉淀法、絮凝法和離子交換法[2-3]。這些方法存在著一些缺點(diǎn)，如儀器設(shè)備昂貴、無(wú)法實(shí)現(xiàn)自動(dòng)監(jiān)控、試劑和能源損耗巨大、各種廢棄物的產(chǎn)生造成二次污染等，而且這些方法用于治理低濃度廢水時(shí)效果不好，不能使金屬濃度降到排放標(biāo)準(zhǔn)以下。微生物吸附法是一種新興的高效、環(huán)保、經(jīng)濟(jì)的重金屬污染治理方法，乳酸菌通過(guò)菌體表面吸附和體內(nèi)蓄積作用可有效清除有毒重金屬，如干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)DSM20011[4]、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)GG[5]、糞腸球菌(Enterococcusfaecium)M74[6]、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)Pb71-1[7]、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)CCFM8661[8]、德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii)KLDS1.0207[9]等。乳酸菌作為潛在的重金屬生物清除劑具有較高的研究與應(yīng)用價(jià)值。

但關(guān)于去除重金屬活性乳酸菌的篩選、去除機(jī)制和應(yīng)用方面的研究較少。本研究擬通過(guò)分析乳酸菌對(duì)鉛的吸附作用，判斷乳酸菌對(duì)鉛的耐受性及吸附程度，利用熱力學(xué)模型和動(dòng)力學(xué)模型對(duì)乳酸菌結(jié)合鉛離子的過(guò)程進(jìn)行模擬，研究乳酸菌對(duì)鉛的吸附能力，為利用乳酸菌清除食品中重金屬研究與應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雙歧桿菌(Bifidobacteria，BB)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus，LR)：由陜西科技大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供；

MRS培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；

其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

恒溫振蕩搖瓶柜：HYG-A型，蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

分光光度計(jì)：722E型，上海光譜儀器有限公司；

壓蓋型冷凍干燥機(jī)：SCIENTZ-18N型，新芝凍干設(shè)備公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的耐鉛試驗(yàn) 在無(wú)菌條件下，配制1 g/L鉛離子溶液，用該鉛離子溶液溶解MRS肉湯培養(yǎng)基，分別得到含50，150，500 mg/L鉛離子的MRS液體培養(yǎng)基。將培養(yǎng)到第三代至對(duì)數(shù)期的菌液用生理鹽水稀釋，調(diào)整OD600 nm為0.60，即得到種子液，按照2%接種量接種于上述含鉛MRS液體培養(yǎng)基中，在37 ℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)，分別在0，2，4，6，8，12，16，20，24 h時(shí)取樣，進(jìn)行乳酸菌計(jì)數(shù)，以確定乳酸菌對(duì)不同濃度鉛離子的耐受力[10]。

1.3.2 鉛含量的測(cè)定 二硫腙比色法[11]。

1.3.3 乳酸菌對(duì)鉛的吸附特性 取菌液0.2 mL接種到MRS培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)18 h，4 000 r/min離心20 min，棄上清液，濕菌備用。

(1) pH值對(duì)吸附的影響：將50 mg/L鉛離子溶液分裝至錐形瓶中，每瓶20 mL，用0.1 mol/L鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至2，3，4，5，6，7，加入濕菌體，使其濃度為1 g/L，并在30 ℃、150 r/min的搖床中吸附1 h，將溶液以8 000 r/min 離心10 min，測(cè)定上清液中的鉛含量。按式(1)計(jì)算菌體對(duì)鉛的吸附量。

(1)

式中：

q——菌體吸附量，mg/g；

C0——初始鉛離子濃度，mg/L；

C1——平衡液中鉛離子濃度，mg/L；

V——鉛離子溶液的體積，L；

m——濕菌體的質(zhì)量，g。

(2) 初始鉛離子濃度對(duì)吸附的影響：鉛離子溶液濃度分別為25，50，75，100，150，300，500 mg/L，pH調(diào)為 6，其他操作與1.3.3(1)相同。

(3) 初始濕菌添加量對(duì)吸附的影響：向20 mL、50 mg/L鉛離子溶液中加入濕菌體，使其濃度分別為1，2，3，4，5，6，7 g/L，pH調(diào)為 6，其他操作與1.3.3(1)相同。

1.3.4 吸附熱力學(xué)試驗(yàn) 配制10，20，30，40，50 mg/L鉛離子溶液，pH調(diào)為6。將收集到的菌體分別置于不同鉛離子濃度溶液中，使菌體濃度達(dá)到1 g/L(濕菌體重)，37 ℃條件下振蕩吸附1 h，8 000 r/min離心10 min，取上清測(cè)鉛離子濃度。按式(1)計(jì)算吸附量。

1.3.5 吸附動(dòng)力學(xué)試驗(yàn) 選取pH值為6，初始鉛離子濃度為50 mg/L，濕菌體濃度為1 g/L來(lái)探究鉛吸附的動(dòng)力學(xué)規(guī)律。30 ℃，150 r/min分別培養(yǎng)5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60 min后取出，將溶液以8 000 r/min離心10 min，測(cè)定上清液中的鉛含量[12]35-36。按式(1)計(jì)算吸附量。

1.3.6 熱力學(xué)分析

(1) Langmuir模型分析：該模型假設(shè)吸附劑表面的吸附位點(diǎn)是均勻的，金屬吸附于表面單分子層，每個(gè)吸附位點(diǎn)對(duì)應(yīng)一個(gè)金屬離子，是以化學(xué)吸附為主的，吸附和解吸是動(dòng)態(tài)平衡。Langmuir 模型見(jiàn)式(2)。

(2)

式中：

qe——平衡時(shí)菌體吸附量，mg/g；

qm——最大吸附量，mg/g；

Ce——平衡液中鉛離子濃度，mg/L；

b——吸附系數(shù)，L/mg。

(2) Freundlich模型分析：該模型假設(shè)的是吸附發(fā)生在非均勻介質(zhì)表面，F(xiàn)reundlich模型見(jiàn)式(3)。

(3)

式中：

qe——平衡時(shí)菌體吸附量，mg/g；

Ce——平衡液中鉛離子濃度，mg/L；

k——吸附平衡常數(shù)。

(3) Langmuir-Freundlich模型分析：Langmuir-Freundl-ich模型見(jiàn)式(4)。

(4)

式中：

qe——平衡時(shí)菌體吸附量，mg/g；

Ce——平衡液中鉛離子濃度，mg/L；

k——吸附平衡常數(shù)；

b——不均勻吸附常數(shù)。

1.3.7 動(dòng)力學(xué)分析

(1) 準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型分析：準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型見(jiàn)式(5)。

(5)

式中：

qe——平衡時(shí)菌體吸附量，mg/g；

qt——t時(shí)刻菌體吸附量，mg/g；

k1——吸附平衡常數(shù)。

(2) 準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型分析：準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型見(jiàn)式(6)。

(6)

式中：

qe——平衡時(shí)菌體吸附量，mg/g；

qt——t時(shí)刻菌體吸附量，mg/g；

k2——吸附平衡常數(shù)。

2 結(jié)果分析

2.1 乳酸菌對(duì)鉛的耐受性

如圖1所示，鉛離子濃度由50 mg/L增加到500 mg/L，雙歧桿菌和鼠李糖桿菌的生長(zhǎng)雖然受到一定抑制，但仍能生長(zhǎng)。如當(dāng)鉛離子濃度為50 mg/L時(shí)，培養(yǎng)24 h其生物量分別為對(duì)照的71.4%和64.3%。當(dāng)鉛離子濃度達(dá)到500 mg/L時(shí)，培養(yǎng)24 h其生物量分別為對(duì)照的35.7%和21.4%。根據(jù)《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(GB 3838—2002)，Ⅴ類水中鉛的含量要求<0.1 mg/L，可見(jiàn)50 mg/L這個(gè)濃度較大，這兩株菌的耐鉛能力較好，以此濃度進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 乳酸菌對(duì)鉛的吸附特性

2.2.1 pH值對(duì)吸附的影響 初始pH值對(duì)雙歧桿菌和鼠李糖乳桿菌吸附鉛能力的影響見(jiàn)圖2。鉛溶液初始pH值由2增加到7，雙歧桿菌對(duì)鉛離子吸附量由45.25 mg/g增加到48.67 mg/g，鼠李糖乳桿菌對(duì)鉛離子吸附量由43.67 mg/g增加到44.71 mg/g。在pH為6～7時(shí)達(dá)到最大吸附值。初始pH值是影響微生物吸附重金屬的重要因素之一。pH值影響菌體表面官能團(tuán)(氨基、羧基、磷酸基)的活力及鉛離子對(duì)結(jié)合位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)力。當(dāng)溶液pH值很低時(shí)，[H3O]+會(huì)占據(jù)生物細(xì)胞表面大量的活性吸附位點(diǎn)，阻止陽(yáng)離子與這些吸附位點(diǎn)的結(jié)合，因此過(guò)酸的環(huán)境導(dǎo)致微生物對(duì)鉛離子的排斥力越大，吸附量下降。隨著溶液中pH值的升高，細(xì)胞表面暴露出更多的負(fù)電荷，有利于鉛接觸并吸附在細(xì)胞表面活性位點(diǎn)上。當(dāng)pH值過(guò)高，達(dá)到鉛離子的溶度積Ksp值后，會(huì)生成氫氧化鉛沉淀，無(wú)法體現(xiàn)生物吸附作用對(duì)鉛的去除效果，因此本試驗(yàn)不考慮pH值超過(guò)7的吸附情況。

2.2.2 初始鉛離子濃度對(duì)吸附的影響 由圖3可知，當(dāng)鉛離子濃度在25～500 mg/L時(shí)，隨著鉛離子濃度的增加，雙歧桿菌對(duì)鉛離子的吸附量由24.29 mg/g增加到109.57 mg/g，鼠李糖乳桿菌對(duì)鉛離子吸附量由21.86 mg/g增加到112.71 mg/g。但當(dāng)鉛離子濃度超過(guò)100 mg/L時(shí)，吸附量基本保持不變。可能是鉛離子超過(guò)菌體的結(jié)合位點(diǎn)，達(dá)到菌體的吸附極限，因此吸附量基本不變。

2.2.3 初始濕菌量對(duì)吸附的影響 由圖4可知，在20 mL、50 mg/L 鉛離子溶液中，初始濕菌量由0.02 g增加到0.14 g，雙歧桿菌和鼠李糖桿乳桿菌對(duì)鉛的吸附量分別由48.75，49.36 mg/g降低到45.08，43.85 mg/g。原因可能是初始濕菌量過(guò)高時(shí)，菌體會(huì)相互吸附成團(tuán)，造成結(jié)合位點(diǎn)減少，進(jìn)而吸附率降低[13]；菌體向細(xì)胞外分泌酸性物質(zhì)，會(huì)改變吸附體系pH值，從而改變菌體表面的物化性質(zhì)，并進(jìn)一步減弱菌體對(duì)鉛的吸附能力。這與嗜麥芽窄食單胞菌對(duì)銅、鎘的吸附特性[14]以及嗜酸乳桿菌和羅伊氏乳桿菌對(duì)銅結(jié)合性能[15]相一致。

圖1 兩株乳酸菌在含鉛培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線Figure 1 Growth curves of two strains of Lactobacillus in lead-containing medium

圖2 初始pH值對(duì)兩株乳酸菌吸附鉛能力的影響Figure 2 Effect of initial pH on adsorption of lead in two strains of Lactobacillus

圖3 初始鉛離子濃度對(duì)兩株乳酸菌吸附鉛能力的影響Figure 3 Effect of lead ion concentration on adsorption of lead in two strains of Lactobacillus

圖4 初始濕菌添加量對(duì)兩株乳酸菌吸附鉛能力的影響Figure 4 Effect of initial wet bacteria weight on adsorption of lead in two strains of Lactobacillus

2.3 熱力學(xué)分析

將Langmuir公式[式(2)]變形，以1/qe為縱坐標(biāo)，1/ce為橫坐標(biāo)，作圖擬合得出雙歧桿菌qmax為42.86 mg/g，b為0.086，R2為0.972 9，但擬合結(jié)果和實(shí)際值48.76 mg/g相差較大；鼠李糖乳桿菌qmax為43.31 mg/g，b為0.085，R2為0.975 8，擬合結(jié)果和實(shí)際值48.14 mg/g相差也較大。說(shuō)明兩株菌吸附鉛過(guò)程中的吸附位點(diǎn)是不均勻的，也不是單分子層吸附。

將Freundlich公式[式(3)]變形，以lnqe為縱坐標(biāo)，lnce為橫坐標(biāo)，作圖擬合得出雙歧桿菌k為2.473，n為0.398，R2為0.837 4；鼠李糖乳桿菌k為2.364，n為0.406，R2為0.838 4。

2.4 動(dòng)力學(xué)模型分析

將準(zhǔn)一級(jí)模型[見(jiàn)式(5)]和準(zhǔn)二級(jí)模型[見(jiàn)式(6)]作圖擬合得出，準(zhǔn)一級(jí)模型適合吸附過(guò)程的前30 min，而不適合整個(gè)吸附過(guò)程，這主要是由于微生物對(duì)重金屬的吸附屬于被動(dòng)吸收[17]，而不是主動(dòng)運(yùn)輸，因此吸附速度較快。前30 min的擬合相關(guān)系數(shù)R2分別達(dá)0.892 7和0.879 0。準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型中，兩株菌的R2均為0.999 8，說(shuō)明準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型比準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型更適合表征菌體吸附鉛離子的過(guò)程，且該過(guò)程不是單純的物理吸附，存在其他的離子交換、化學(xué)沉淀等現(xiàn)象。乳酸菌細(xì)胞壁上有帶大量負(fù)電荷官能團(tuán)的肽聚糖和磷壁酸聚合物，因此它們有很強(qiáng)的吸收金屬陽(yáng)離子的能力。Teemu 等[18]研究發(fā)現(xiàn)帶有負(fù)電荷的磷酰基、羧基具有結(jié)合鉛、鎘離子的能力。此外，許多乳酸桿菌中的表面蛋白質(zhì)以 S-layer 蛋白質(zhì)[12]19為主，其官能團(tuán)一般帶負(fù)電荷，可以與陽(yáng)離子發(fā)生沉淀。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)雙歧桿菌和鼠李糖乳桿菌耐鉛能力和吸附鉛的特性進(jìn)行研究，初始鉛離子濃度為50 mg/L條件下其吸附鉛的最佳條件：pH值6，初始濕菌量1 g/L，此時(shí)兩株菌對(duì)鉛的吸附率分別為97.44%和96.87%；Langmuir-Freundlich模型比Langmuir模型和Freundlich模型更適合兩株菌結(jié)合鉛離子的過(guò)程，準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型比準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型更適合，說(shuō)明兩株菌與鉛的作用包括物理吸附和化學(xué)吸附。

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