謝晶晶，李 博，姚 兵，宋 烜，張平超，陸 驊

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(marrow mesenchymal stem cells，MSCs)是一種多分化潛能細(xì)胞，在骨量維持和骨修復(fù)中起了極其重要的作用。然而，隨著年齡增加，骨髓MSCs向成骨、成軟骨細(xì)胞分化的能力減弱，是造成骨質(zhì)疏松和骨折延緩愈合的直接原因[1]近年來，我國骨質(zhì)疏松癥發(fā)病率上升，由此發(fā)生的骨折、骨折并發(fā)癥及重要關(guān)節(jié)功能喪失的患者增多；自體骨髓MSCs移植治療骨折不愈合的效果已得到肯定[2-3]，其效果與MSCs數(shù)量和活性直接相關(guān)；但應(yīng)用于骨質(zhì)疏松或骨質(zhì)疏松骨折治療的研究尚不多見。本研究以SD大鼠為載體，先采集大鼠MSCs凍存，再制備骨質(zhì)疏松模型，將采集的MSCs回輸至大鼠體內(nèi)發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用，主要觀察MSCs的分離、鑒定及凍存時(shí)間對(duì)細(xì)胞活性的影響，從而為該類疾病的治療提供新方向。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)3周齡雄性SD大鼠6只，體重(50±10)g，由中科院上海動(dòng)物房提供，許可證號(hào)：SCXK(滬)2013-0005。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器與試劑 胎牛血清、雙抗、淋巴細(xì)胞分離液、胰蛋白酶、RPMI 1640培養(yǎng)液均購自美國Gibco公司；CD29，CD90，CD11B，CD45抗體均購自美國Invitrogen公司；終末期糖基化牛血清白蛋白、牛血清白蛋白均購自美國CALBIOCAM公司；甲基噻唑基四唑(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)均購自美國SIGMA公司；大鼠骨髓MSCs成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基和成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基購自賽業(yè)生物。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1大鼠骨髓MSCs的分離培養(yǎng)：將3周齡SD雄性大鼠6只全部斷頸處死，取股骨和脛骨，并剪去兩端，露出骨髓腔，使用含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清+雙抗的培養(yǎng)液，沖洗骨髓腔，反復(fù)2次，打散細(xì)胞懸液后，使用70 μm細(xì)胞篩過濾，去除細(xì)胞團(tuán)塊。用相對(duì)密度1.077的淋巴細(xì)胞分離液做梯度離心(2000 r/min，離心30 min)。收集單核細(xì)胞界面層，再次離心(1000 r/min，離心10 min)，棄上清后，使用原代細(xì)胞培養(yǎng)液打散重懸細(xì)胞。細(xì)胞懸液接種于100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，在37℃，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)48 h，然后去除未貼壁細(xì)胞，每48 h換液1次。

1.3.2流式細(xì)胞法鑒定MSCs表面標(biāo)志物：原代細(xì)胞生長至培養(yǎng)皿95%左右體積時(shí)，開始傳代培養(yǎng)；以移液器吸取第2代細(xì)胞若干，用胰蛋白酶消化、含體積分?jǐn)?shù)為5%胎牛血清的PBS重懸,并調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/ml；鑒定MSCs表面標(biāo)記物CD29和CD90及造血干細(xì)胞(HSCT)表面標(biāo)記物CD11B和CD45的陽性表達(dá)情況，合格的MSCs應(yīng)表達(dá)CD29和CD90，而不表達(dá)CD11B和CD45。主要步驟：每個(gè)流式管各取100 μl細(xì)胞混懸液，加入待測(cè)抗體；設(shè)立對(duì)照組，取100 μl細(xì)胞混懸液加入同型對(duì)照抗體；4℃避光孵育30 min，漂洗2次后移除去上清，控干后每管加入0.5 ml固定液，上機(jī)檢測(cè)。先檢測(cè)同型對(duì)照管，調(diào)整電壓至陰性區(qū)范圍，再測(cè)實(shí)待測(cè)抗體管[4]。

1.3.3MSCs的凍存：配置MSCs凍存體系，體系構(gòu)成為10%DMSO+30%胎牛血清+60%DMEM-LG培養(yǎng)基。將培養(yǎng)好的第2代細(xì)胞吸除培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移至凍存體系；根據(jù)考察時(shí)間點(diǎn)，每只大鼠的MSCs均先分裝為4管，管1不凍存，直接培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，測(cè)定增殖活力和多向分化能力；管2、3、4先置于4℃環(huán)境保存2 h，再置于-20℃環(huán)境保持2 h，再轉(zhuǎn)移至-70℃超低溫環(huán)境凍存。

1.3.4MSCs的復(fù)蘇：管2、3、4分別于凍存1周、1個(gè)月、6個(gè)月復(fù)蘇細(xì)胞。復(fù)蘇步驟：將凍存管37℃水浴，至溶解90%左右時(shí)移入37℃預(yù)熱的DMEM培養(yǎng)基，1000 r/min離心5 min，棄上清液，培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，錐蟲藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)目，復(fù)蘇率=(活細(xì)胞數(shù)目/總細(xì)胞數(shù)目)×100%。復(fù)蘇后的細(xì)胞調(diào)整為1×108/L，在37℃體積分?jǐn)?shù)為5% CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)72 h，達(dá)到對(duì)數(shù)生長期時(shí)，測(cè)定其增殖活力和多向分化能力。

1.4MTT法測(cè)定MSCs增殖活力 分別于凍存前，凍存1周、1個(gè)月、6個(gè)月復(fù)蘇細(xì)胞，收集生長至對(duì)數(shù)期的待測(cè)骨髓MSCs，以1×104/ml接種于96孔板，置于37℃體積分?jǐn)?shù)為5% CO2溫箱中培養(yǎng)，分別于處理1 d、2 d......7 d吸去上清液，PBS洗滌，棄上清液，每孔加入10 μl新鮮RPMI 1640培養(yǎng)液，再加入20 μl MTT溶液(5 g/L，即0.5%)繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄上清液后，每孔加入150 μl DMSO，置搖床上低速連續(xù)振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm處測(cè)量各孔的吸光度值，每組設(shè)定3個(gè)復(fù)孔，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。

1.5誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)測(cè)定MSCs多向分化能力 收集生長至對(duì)數(shù)期的待測(cè)骨髓MSCs，以1×104/ml接種于96孔板中，以大鼠骨髓MSCs成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基培養(yǎng)(培養(yǎng)基由MSCs專用胎牛血清、谷氨酰胺、雙抗、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉及地塞米松按照一定的配比組成)。37℃，5%CO2培養(yǎng)7 d，隔天換液1次，7 d后吸除剩余培養(yǎng)基，茜素紅染色，染色液含5 mg/L茜素紅S+0.1M Tris，PH=1，共染色15 min，倒置熒光鏡下觀察被染紅的鈣結(jié)節(jié)數(shù)目。按照同樣的方法，以大鼠骨髓MSCs成脂分化培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)7 d后油紅O染色15 min，倒置熒光鏡觀察被染黃的脂滴形成數(shù)目。

2 結(jié)果

2.1大鼠骨髓MSCs培養(yǎng)與鑒定 分離自骨髓的細(xì)胞在培養(yǎng)1個(gè)月后出現(xiàn)細(xì)胞克隆，呈纖維細(xì)胞樣生長。見圖1。MSCs細(xì)胞表面CD29和CD90的陽性表達(dá)率分別為97.9%和97.4%，HSCT細(xì)胞表面CD11B和CD45的陽性表達(dá)率分別為9.8%和7.7%，同時(shí)細(xì)胞表面CD11B陰性表達(dá)率為90.2%，CD45陰性表達(dá)率為92.3%，說明上述纖維細(xì)胞樣細(xì)胞基本為骨髓MSCs，且均一性好。見圖2。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)2代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物

2.2凍存不同時(shí)間對(duì)大鼠骨髓MSCs增殖活力的影響 凍存1周、1個(gè)月和6個(gè)月，大鼠骨髓MSCs復(fù)蘇率分別為68.4%、66.3%、64.8%。隨著凍存時(shí)間延長，細(xì)胞增殖速率稍有減慢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，凍存6個(gè)月的細(xì)胞增殖活力也處于較穩(wěn)定水平內(nèi)。復(fù)蘇細(xì)胞的增殖曲線見圖3。

圖3大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凍存時(shí)間對(duì)增殖曲線的影響

2.3凍存不同時(shí)間對(duì)大鼠骨髓MSCs多向分化能力的影響 凍存前、凍存1周、1個(gè)月和6個(gè)月，大鼠骨髓MSCs成骨誘導(dǎo)后鈣結(jié)節(jié)數(shù)目和油滴數(shù)目稍有降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)后采用茜素紅染色，鈣結(jié)節(jié)被染成棕色，鈣結(jié)節(jié)數(shù)目越多，成骨分化能力越強(qiáng)；成脂分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)后，油紅O染色，液化脂肪被染成橙紅色，呈油滴狀，油滴越多，成脂分化能力越強(qiáng)。見圖4。

3 討論

目前國內(nèi)大鼠骨髓MSCs的提取方法多采用密度梯度分離法聯(lián)合貼壁培養(yǎng)手段[5-6]。骨髓所含的細(xì)胞種類極為豐富，密度梯度離心可去除骨髓中的紅細(xì)胞、免疫細(xì)胞及脂肪細(xì)胞等，貼壁培養(yǎng)的目的在于進(jìn)一步去除造血干細(xì)胞等非貼壁細(xì)胞。本研究用該方案提取大鼠MSCs，其優(yōu)點(diǎn)在于操作簡便，所得細(xì)胞活性和純度相對(duì)較高，能夠滿足一般實(shí)驗(yàn)需求；獲得的細(xì)胞MSCs表面CD29和CD90的陽性表達(dá)率分別為97.9%，97.4%；MSCs表面和CD11B和CD45的陽性表達(dá)率分別為9.8%和7.7%；說明所獲得的MSCs純度可達(dá)90%，且均一性較好。

表1 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凍存不同時(shí)間對(duì)多向分化能力的影響

圖4骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞多向分化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)染色后典型圖片(HE×200)

A.成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)后茜素紅染色，著色者為鈣結(jié)節(jié)；B.成脂分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)后油紅O染色，著色者為油滴

凍存和復(fù)蘇骨髓MSCS非常關(guān)鍵，是保持其應(yīng)用效果的重要條件之一。既往文獻(xiàn)報(bào)道[7-8]，與MSCs低溫凍存質(zhì)量密切相關(guān)的三要素是降溫步驟、凍存液、凍存溫度及復(fù)蘇速率。降溫速度主要影響細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)結(jié)冰過程中的滲透壓，如果直接過度到超低溫環(huán)境容易引發(fā)細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)反應(yīng)，進(jìn)一步引發(fā)細(xì)胞器損壞和細(xì)胞膜滲漏[9-10]，因此需在4℃環(huán)境中緩沖2～4 h，本研究采用梯度降溫法，4℃和-20℃各緩沖2 h，再轉(zhuǎn)移至-70℃。何潔等[11]指出液氮凍存效果較-70℃環(huán)境更好，但基于-70℃環(huán)境凍存條件更加方便，本研究直接以-70℃超低溫冰箱進(jìn)行存儲(chǔ)。凍存液的配置參照李秀森的改良方案[12]，以10%DMSO+30%胎牛血清+60%DMEM-LG培養(yǎng)基為存儲(chǔ)體系。最終考察凍存1周、1個(gè)月和6個(gè)月的細(xì)胞活性，結(jié)果顯示快速復(fù)蘇后，大鼠骨髓MSCs 1周，1個(gè)月和6個(gè)月的復(fù)蘇率分別為68.4%、66.3%、64.8%，與文獻(xiàn)一致[13-14]。

本研究結(jié)果顯示，MSCs增殖曲線基本符合“S”型規(guī)律[15-16]，有較明顯的平臺(tái)期、對(duì)數(shù)生長期和生長后下降趨勢(shì)。凍存前、凍存1周、凍存1個(gè)月和凍存6個(gè)月的增殖曲線較為接近，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的增殖速率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。多向分化能力是MSCs的典型重要特征，是指在特定的誘導(dǎo)條件下，MSCs可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌肉細(xì)胞或脂肪細(xì)胞，這也是MSCs可通過歸巢效應(yīng)治療多種疾病的根本原因[17]。本研究結(jié)果顯示，隨著凍存時(shí)間延長，大鼠骨髓MSCs成骨和成脂肪能力與治療前比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證實(shí)在6個(gè)月的凍存期內(nèi)，細(xì)胞活性得到了良好的保持。

綜上所述，采用密度梯度分離法聯(lián)合貼壁培養(yǎng)可成功提取大鼠骨髓MSCs；配置的凍存體系也可在-70℃超低溫環(huán)境中較長時(shí)間保持MSCs活性，有利于其后續(xù)研究。

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