□ 姜 珊 王振雷 吉林省遼源市食品質(zhì)量安全檢測中心

魚鱗中的膠原蛋白是生物體內(nèi)一種重要的蛋白質(zhì)，也是結(jié)締組織的重要蛋白成分，水產(chǎn)膠原蛋白具有比陸生動物膠原蛋白更高的安全性和更多的優(yōu)點。膠原中約50%的脯氨酸被羥基化成為4Hyp和少量3Hyp。作為氨基酸的主要組成部分而存在膠原蛋白中，約占膠原蛋白總量的10%，但不存在于一般蛋白質(zhì)中，通過測定羥脯氨酸的含量再乘以相應(yīng)的系數(shù)就可以得到膠原蛋白的含量。

本研究旨在找到一個微波輔助水解魚鱗測定魚鱗中羥脯氨酸的最佳實驗條件，為魚鱗蛋白水解提供一個確切的羥脯氨酸測定標準，并為魚鱗中羥脯氨酸的開發(fā)利用提供一個科學(xué)有效的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-4（國華電器有限公司）、電子天平FA2104（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）、分光光度計723A（上海精密儀器科技有限公司）。

1.2 材料與試劑

原料：新鮮鯽魚魚鱗。試劑：10%NaCl溶液、鹽酸、L-羥脯氨酸、高氯酸、醋酸鈉、檸檬酸三鈉、檸檬酸、異丙醇、對二甲氨基苯甲醛均為國產(chǎn)分析純。

1.3 試驗方法

1.3.1 魚鱗預(yù)處理及脫鈣

取新鮮鯽魚魚鱗，用10%的中性NaCl溶液浸泡10 h并去除雜蛋白和魚銀，晾干備用，加入0.4 mol/L的鹽酸進行20 min脫鈣，烘干制粉備用。

1.3.2 試驗試劑的配制

醋酸-檸檬酸緩沖溶液（PH=6）的配制：57 g醋酸鈉、37.5 g檸檬酸三鈉、5.5 g檸檬酸和385 mL異丙醇一起定容于1 000 mL容量瓶保存。測定前將7%氯胺-T溶液和醋酸檸檬酸緩沖液按1∶4體積混合，得氧化劑溶液（A液）。

顯色劑的配制：取10 g對二甲氨基苯甲醛溶解于15 mL高氯酸水溶液中，于測定前將對二甲氨基苯甲醛溶液和異丙醇3∶13體積混合，即顯色劑溶液（B液）。

1.3.3 標樣曲線的繪制

稱取L-羥脯氨酸制0.054 5 g/L羥脯氨酸標準溶液。分別取3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mL，溶液定容到10 mL容量瓶中，分別加入1 mL檸檬酸緩沖液和1 mL 0.05 mol/L氯胺-T溶液，室溫（25 ℃）氧化10 min后，加入高氯酸1 mL，放置10 min，最后加入對二甲基氨基苯甲醛顯色試劑1 mL，在65 ℃水浴顯色10 min，冷卻后在561 nm處測吸光度，繪制標準曲線。

1.3.4 微波輔助法水解試驗設(shè)計

分別稱取5份10 g魚鱗樣品于250 mL錐形瓶中，加入20 mL鹽酸，放入微波爐中進行微波處理。趁熱將水解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中，用10 mL鹽酸分三次洗滌錐形瓶，用水定容，搖勻。準確移取6 mL上述溶液于100 mL容量瓶中，用水定容，加入3 mL氧化劑溶液（A液）氧化10 min后，加入高氯酸1 mL，放置10 min最后加入B液1 mL，在65 ℃水浴顯色10 min，冷卻后在最高吸收峰561 nm處測吸光度測定其吸光度。通過單因素和正交試驗考察微波時間、微波功率、鹽酸濃度對測定羥脯氨酸的顯著影響，并確定水解條件的最佳組合。

2 結(jié)果與分析

2.1 羥脯氨酸標準曲線的繪制

測定標準曲線，如圖1所示。

計算其回歸方程為：

A=0.054*C+0.083

A——吸光度；C——羥脯氨酸濃度ug/mL；相關(guān)系數(shù)R=0.996

2.2 微波輔助水解魚鱗條件的優(yōu)化

單因素試驗表明，微波時間、微波功率和鹽酸濃度對羥脯氨酸濃度均有影響。因此，通過L9（34）正交試驗，進一步研究它們的影響。正交試驗結(jié)果見表1。

由表1分析，可以看出微波輔助水解魚鱗測定羥脯氨酸的最佳工藝組合是A2B2C3和A2B1C3。A因素微波時間和C因素鹽酸濃度的Sig值小于0.05，對實驗結(jié)果有顯著影響，B因素微波功率對試驗結(jié)果影響不顯著。通過驗證試驗A2B2C3的Hyp濃度為12.527，A2B1C3的Hyp濃度12.316，所以最佳水解條件組合為A2B2C3。

3 結(jié)論

圖1 羥脯氨酸標準曲線

表1 正交試驗表

微波輔助水解法測定魚鱗中羥脯氨酸的最佳試驗條件是A2B2C3，即微波時間8 min，微波功率中低火480 W，鹽酸濃度7 mol/L，其中微波時間和鹽酸濃度對試驗結(jié)果有顯著影響，微波功率對試驗結(jié)果影響不顯著。

[1]王紅道,鄭云峰,黃曉麗,等.比色法測定乳制品中羥脯氨酸含量[J].科技信息, 2009(25).

[2]焦道龍,陸劍鋒,張偉偉,等.水產(chǎn)動物膠原蛋白的研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢[J].食品科學(xué),2009(17).

[3]張豐香,許時嬰,王璋.魚鱗明膠生產(chǎn)的浸酸脫鈣工藝研究[J].食品科技,2008(3).