柏 韻,李 然,+,郭雪松,*,張 振,2,*,張冬陽,張立斌,李 亮

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧錦州 121001;2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧沈陽 110866)

中國對(duì)蝦,又稱東方對(duì)蝦,與墨西哥棕蝦、圭亞那白蝦齊名,并稱世界三大名蝦,是我國分布最廣的對(duì)蝦類[1]。中國對(duì)蝦的蛋白質(zhì)含量豐富而脂肪含量較低[2],是典型的高蛋白、低脂肪型食物,對(duì)人體健康具有重要意義。然而,由于蝦肉中蛋白質(zhì)和水分的含量較高,肌肉組織較松軟,死后僵硬期短,自溶作用迅速,導(dǎo)致其新鮮度下降快,易腐敗變質(zhì),嚴(yán)重影響其營養(yǎng)價(jià)值和食用性[3]。因此,蝦的保鮮問題已經(jīng)成為人們研究的熱點(diǎn)。

殼聚糖又稱可溶性甲殼質(zhì),具有良好的成膜性能、抑菌性能、安全性、微生物降解性等優(yōu)良性能被各行各業(yè)廣泛關(guān)注[4-5],其作為保鮮劑正日益成為果蔬貯藏保鮮研究的熱點(diǎn)。ε-聚賴氨酸是一種營養(yǎng)型抑菌劑[6],因其安全性高于其他化學(xué)防腐劑且抑菌譜廣，被用于食品防腐[7]?？ɡz作為增稠劑同樣被廣泛的應(yīng)用于食品中[8-9]。本實(shí)驗(yàn)將三種物質(zhì)進(jìn)行復(fù)合,通過預(yù)實(shí)驗(yàn)得到最優(yōu)配比,同時(shí)以無處理組和單獨(dú)涂膜組為對(duì)照,對(duì)中國對(duì)蝦進(jìn)行涂膜處理,以感官評(píng)定、菌落總數(shù)、pH、TVB-N、TBA、質(zhì)構(gòu)特性、SDS-PAGE凝膠電泳為指標(biāo),探究不同涂膜處理對(duì)中國對(duì)蝦新鮮度的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

中國對(duì)蝦 平均體重(15±2) g的中國對(duì)蝦,購自中國錦州市大潤發(fā)超市;殼聚糖 脫乙酰度為大于85%,食品級(jí);卡拉膠 河南洪鑫食化有限公司;ε-聚賴氨酸 山東欣鼎生物科技有限公司;營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 生工生物工程(上海)股份有限公司;硫代巴比妥酸、Tris、SDS、丙烯酰胺 北京索萊寶科技有限公司;1,1,3,3-四乙氧基丙烷 酷爾化學(xué)科技(北京)有限公司;三氯乙酸、磷酸三丁酯、鹽酸、冰醋酸、EDTA、氧化鎂,硼酸 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;甘氨酸、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(N,N,N′,N′-tetramethylethylenediamine,TEMED)、巰基乙醇、過硫酸銨、溴酚藍(lán)、甲醇 天津市大茂化學(xué)試劑廠;考馬斯亮藍(lán)R-250 天津市博迪化工有限公司。

WDP-9062電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海安亭科學(xué)儀器有限公司;PHS-3C型精密pH計(jì) 上海雷磁儀器有限公司;分析天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司;電子萬用爐 天津市泰斯特儀器有限公司;追直流超凈工作臺(tái) 上海智城分析儀器制造有限公司;電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司;UV-6300型紫外可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司;立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;KQ3200B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;TMS-PRO型質(zhì)構(gòu)儀 北京盈盛恒泰科技有限公司;美國BIO-RAD PowerPac Basic電泳儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 涂膜液的制備 將1.5 g殼聚糖溶解在含1%冰醋酸的蒸餾水中,制備1.5%的殼聚糖涂膜液,記為殼聚糖組;稱取0.15 g ε-聚賴氨酸蒸餾水定容至100 mL,記為ε-聚賴氨酸組;稱取1.5 g殼聚糖、0.13 g ε-聚賴氨酸、0.19 g卡拉膠,用含1%冰醋酸的蒸餾水定容至100 mL,記為復(fù)合組。將購買的中國對(duì)蝦隨機(jī)分為四組,無任何處理的記為空白對(duì)照組,其余三組分別在不同的保鮮劑中浸泡5 min,取出于室溫瀝干,分裝到聚乙烯無菌保鮮袋中后,貯藏于4 ℃冰箱中。

1.2.2 感官評(píng)定 根據(jù)趙海鵬感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行改動(dòng)[10]。評(píng)定小組由7人組成(六女一男),蝦的評(píng)定項(xiàng)目由體表色澤、氣味、肌肉形態(tài)組成,總分值在12分(非常新鮮)和3分(完全腐敗)之間,6分以下為不可接受,具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 感官評(píng)定評(píng)分表Table 1 Sensory evaluation scores table

1.2.3 菌落總數(shù) 參照國標(biāo)GB 4789.2-2010,食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)的測(cè)定[11]。

1.2.4 pH的測(cè)定 稱取1 g剁碎的蝦肉,加入9 mL煮沸后冷卻的蒸餾水,均勻攪拌,靜置30 min,用pH計(jì)測(cè)定上清液pH。

1.2.5 揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)的測(cè)定 參照GB 5009.228-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定[12],按半微量定氮法測(cè)定TVB-N。

1.2.6 硫代巴比妥酸值的測(cè)定 準(zhǔn)確稱取5 g樣品,置于100 mL有蓋三角瓶內(nèi),加入25 mL三氯乙酸混合液,振搖0.5 h,用雙層濾紙過濾,除去油脂。濾液重復(fù)用雙層濾紙過濾一次。準(zhǔn)確移取上述濾液5 mL置于25 mL比色管內(nèi),加入5 mL TBA溶液,混勻,加塞,置于90 ℃水浴內(nèi)保溫40 min,取出,冷卻1 h,移入小試管內(nèi),離心5 min,上清液傾入25 mL納氏比色管中,加入5 mL氯仿,搖勻,靜置,分層,吸出上清液于532 nm波長比色,對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線得到微克數(shù)(同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn))。

1.2.7 質(zhì)構(gòu)特性的測(cè)定 選取對(duì)蝦第二節(jié)約1 cm3大小,測(cè)定探頭為直徑50 mm的P50平底柱形探頭,測(cè)試參數(shù)設(shè)定為:初始力度:0.8 N、探頭回升高度:25 mm、測(cè)試速度:60 mm/min、行變量30%[13]。

1.2.8 SDS-PAGE凝膠電泳

1.2.8.1 肌原纖維蛋白的提取 隨著貯藏時(shí)間的增加,蛋白質(zhì)中降解最快的即為肌原纖維蛋白,本實(shí)驗(yàn)將貯藏第10 d的中國對(duì)蝦進(jìn)行肌原纖維蛋白提取,通過比較不同降解程度探究涂膜處理對(duì)保鮮的影響。參考Xiong等[14]的方法并加以修改。將蝦肉攪碎,加入4倍體積磷酸鹽緩沖液(pH=7.5),均質(zhì),在4 ℃冷凍離心機(jī)中8000 r/min離心15 min,除去上清液,用4倍體積磷酸鹽緩沖液(pH=7.5)清洗沉淀,離心,重復(fù)三次。最后一次用四層紗布過濾,所得濾液離心,沉淀即為肌原纖維蛋白。

1.2.8.2 分離膠和濃縮膠的配制 按表2中溶液的順序及比例,制備10%的分離膠 4.8%的濃縮膠。

表2 分離膠和濃縮膠配比Table 2 Ratio of separation gel and concentrate

1.2.9 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)表示為平均值,做三次平行,伴隨著平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。SPSS軟件進(jìn)行分析,顯著性p<0.05

2 結(jié)果與分析

2.1 感官評(píng)定

王二霞等[15]的研究表明,感官評(píng)價(jià)快速、簡便,是消費(fèi)者判斷食品新鮮度的主要方式。如圖2所示,中國對(duì)蝦貯藏期間感官品質(zhì)總體呈下降的趨勢(shì),其中空白組下降的最明顯,在第7 d感官評(píng)分為5.9,低于可接受值。殼聚糖涂膜組在第9 d接近腐敗值,這可能是因?yàn)闅ぞ厶峭磕ぬ幚碓谖r的表面形成一層保護(hù)膜,有效地降低微生物的繁殖和對(duì)蝦體內(nèi)蛋白質(zhì)的變化,使得對(duì)蝦的肌肉形態(tài)有了更好的品質(zhì),同樣涂膜處理減少了某些揮發(fā)性物質(zhì)的產(chǎn)生,使得對(duì)蝦的氣味與空白組相比有了較好的評(píng)價(jià)。ε-聚賴氨酸處理組同樣在第9 d接近最低可接受值,ε-聚賴氨酸可以抑制微生物的增長,減少揮發(fā)性物質(zhì)的產(chǎn)生。復(fù)合涂膜處理與前三組相比有更好的感官評(píng)分,在第11 d才達(dá)到不可接受值,與空白組相比延長了4 d。

圖1 中國對(duì)蝦貯藏期間感官評(píng)價(jià)變化Fig.1 Changes in sensory scores of Chinese shrimp during refrigerated storage

圖2 中國對(duì)蝦貯藏期間細(xì)菌總數(shù)變化Fig.2 Changes in total viable counts(TVC)of Chinese shrimp during refrigerated storage

2.2 菌落總數(shù)

根據(jù)M osfer M的研究表明[16],菌落總數(shù)不大于5.0 lg cfu/g為一級(jí)鮮度,5.0～5.7 lg cfu/g為二級(jí)鮮度,達(dá)到106～107cfu/g通常表明已極其腐敗,不能食用,此時(shí)判定為貨架期終點(diǎn)。在本實(shí)驗(yàn)中,新鮮中國對(duì)蝦的菌落總數(shù)為2.2 lg cfu/g左右,屬于一級(jí)鮮度。隨著時(shí)間的增加,菌落總數(shù)逐漸增加,其中無處理的空白組細(xì)菌繁殖的最快,在第3 d達(dá)到4.64 lg cfu/g,第5 d接近二級(jí)鮮度上限,達(dá)到5.52 lg cfu/g,認(rèn)定為腐敗變質(zhì)。其次,殼聚糖單獨(dú)涂膜組細(xì)菌總數(shù)在第7 d為5.58 lg cfu/g接近二級(jí)鮮度限值,說明殼聚糖涂膜具有一定的抑菌性,可以減緩細(xì)菌繁殖的速率,有效的起到保鮮的作用。經(jīng)過ε-聚賴氨酸涂膜處理的對(duì)蝦細(xì)菌總數(shù)在第9 d接近二級(jí)鮮度上限,其抑菌效果更加明顯。與前三組的處理相比,復(fù)合涂膜處理組的細(xì)菌生長速率更加緩慢,在第7 d才達(dá)到二級(jí)鮮度值,第9 d接近限值,且復(fù)合涂膜組細(xì)菌總數(shù)均低于單獨(dú)涂膜組,貨架期較空白組相比延長了4 d,這主要是因?yàn)樵趶?fù)合涂膜液中的殼聚糖和ε-聚賴氨酸存在協(xié)同增效作用,使抑菌效果更好。

2.3 pH

動(dòng)物肌肉pH的變化與其新鮮度密切相關(guān),測(cè)定對(duì)蝦肌肉的pH可以作為判斷其新鮮度的參考標(biāo)準(zhǔn)之一[17]。由圖可知,四組初始pH約為7.01,相互之間的pH差別不大,說明涂膜處理并不影響對(duì)蝦的初始pH。隨著時(shí)間的增加,到第5 d為止,三種處理方法的pH均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì),這是由于蝦死后肌肉中的糖原被降解,生成乳酸等酸類物質(zhì)[18],造成肌肉pH的下降。從第5 d開始,pH開始增加,這是因?yàn)樵谧陨砻负臀⑸锏淖饔孟?蝦肉中的蛋白質(zhì)、氨基酸及其他含氮物質(zhì)被分解為氨、三甲胺、吲哚、組胺等堿性物質(zhì)[19],使得肌肉pH上升。從整體上看,涂膜處理的三組pH上升的較為緩慢,根據(jù)Sham shad[20]的研究表明,pH在7.6以上則認(rèn)為是不可接受的值,從圖中可知,空白組的pH在第9 d達(dá)到7.53,殼聚糖和ε-聚賴氨酸涂膜處理組在第11 d時(shí)pH達(dá)到7.61和7.62,復(fù)合涂膜組在第13 d達(dá)到7.64。涂膜組的pH在貯藏后期明顯低于空白組，說明單獨(dú)涂膜和復(fù)合涂膜處理均可有效地保持中國對(duì)蝦的品質(zhì),延長貨架期。

圖3 中國對(duì)蝦貯藏期間pH變化Fig.3 Changes in pH of Chinese shrimp during refrigerated storage

2.4 TVB-N值

揮發(fā)性鹽基氮也稱揮發(fā)性堿基總氮,是水產(chǎn)品新鮮度評(píng)價(jià)中的經(jīng)典評(píng)定方法,最能反映水產(chǎn)品的新鮮度變化[21]。根據(jù) GB 2733-2005《鮮、凍動(dòng)物性水產(chǎn)品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》[22],海水魚、蝦中揮發(fā)性鹽基氮的可接受值低于30 mg/100 g。不同處理組對(duì)中國對(duì)蝦貯藏期內(nèi)TVB-N值如圖5所示。無處理的空白組TVB-N值開始出現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì),在第9 d達(dá)到30.2 mg/100 g,超出標(biāo)準(zhǔn)。殼聚糖和ε-聚賴氨酸涂膜組同樣出現(xiàn)上升趨勢(shì),但上升的幅度明顯小于無處理組,TVB-N值分別在第11 d達(dá)到29.68和31.92 mg/100 g,區(qū)別不大。復(fù)合涂膜組的TVB-N值在第13 d超出標(biāo)準(zhǔn),同樣比空白組延長4 d,這與其他指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果相同。說明殼聚糖和ε-聚賴氨酸具有抑菌作用,可以有效的降低細(xì)菌對(duì)蛋白質(zhì)的分解,達(dá)到延緩TVB-N含量上升的作用。

圖5 中國對(duì)蝦貯藏期間TVB-N變化Fig.5 Changes in TVB-N values of Chinese shrimp during refrigerated storage

2.5 TBA值

TBA值是用于評(píng)估脂質(zhì)氧化程度所廣泛使用的指標(biāo)[23],與肉類脂肪氧化程度有很強(qiáng)的相關(guān)性,TBA值越大,說明脂肪的氧化程度越高,酸敗就越嚴(yán)重。脂肪酸發(fā)生氧化的降解產(chǎn)物丙二醛(MDA)能夠與TBA反應(yīng)生成穩(wěn)定的紅色復(fù)合物[24]。貯藏期間不同處理方式的TBA值如圖4所示,中國對(duì)蝦的TBA值在起始時(shí)都很低,均在0.05左右。隨著貯藏時(shí)間的增加,四組TBA值均出現(xiàn)上升的趨勢(shì),但涂膜處理組的值均明顯低于無處理的空白組(p<0.05),其中復(fù)合涂膜的效果更加明顯,說明涂膜保鮮可以在一定程度上延緩對(duì)蝦脂肪氧化的程度。

圖4 中國對(duì)蝦貯藏期間TBA變化Fig.4 Changes in TBA values of Chinese shrimp during refrigerated storage

2.6 質(zhì)構(gòu)

2.6.1 硬度 在中國對(duì)蝦的貯藏過程中質(zhì)構(gòu)特性會(huì)發(fā)生改變,其中硬度作為一種測(cè)量指標(biāo)可以較好地反映對(duì)蝦肌肉組織的變化趨勢(shì)[25]。如圖6所示,隨著貯藏時(shí)間的增加,四個(gè)處理組中的蝦肉硬度都呈現(xiàn)先小幅增加,之后逐漸降低的過程,這是由于蝦死后會(huì)經(jīng)過經(jīng)歷僵直、自溶和腐敗3個(gè)階段,在僵直期內(nèi)蝦肉硬度會(huì)有所提高,僵直期解除后硬度開始下降[26]。其中無處理的空白組硬度下降的最快,殼聚糖處理次之,復(fù)合涂膜處理下降緩慢。說明進(jìn)行涂膜處理可以減緩中國對(duì)蝦體內(nèi)酶和微生物的作用,使蝦的自溶期延后,維持較好的硬度。

圖6 中國對(duì)蝦貯藏期間硬度變化Fig.6 Changes in hardness of Chinese shrimp during refrigerated storage

2.6.2 咀嚼性 咀嚼性是指將半固體的樣品阻嚼成吞咽時(shí)的穩(wěn)定狀態(tài)所需的能量[27],如圖7所示,隨著貯藏時(shí)間的增加,咀嚼性總體呈現(xiàn)下降的趨勢(shì),其中空白組下降的最為迅速。蝦死后肌肉中膠原分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,蛋白質(zhì)開始降解,肌原纖維之間結(jié)構(gòu)疏松,導(dǎo)致肌肉軟化,進(jìn)而導(dǎo)致咀嚼性降低,涂膜處理可以延緩蛋白質(zhì)變性,從而使咀嚼性下降緩慢,其中復(fù)合涂膜組效果最好。

圖7 中國對(duì)蝦貯藏期間咀嚼性變化Fig.7 Changes in chewiness of Chinese shrimp during refrigerated storage

2.6.3 彈性 如圖8所示,在中國對(duì)蝦貯藏期間,彈性整體呈下降趨勢(shì)。其中無處理的空白組下降最明顯,復(fù)合涂膜處理最能有效減少彈性的變化。這是由于涂膜處理在中國對(duì)蝦外殼形成新的保護(hù)膜,可以有效地阻礙微生物的生長及蝦肉組織中蛋白質(zhì)的變化。同時(shí),復(fù)合膜中的卡拉膠具有一定的凝膠強(qiáng)度,可以有效地改良膜的性能,使經(jīng)過復(fù)合涂膜液處理的中國對(duì)蝦具有更好的彈性。

圖8 中國對(duì)蝦貯藏期間彈性變化Fig.8 Changes in elasticity of Chinese shrimp during refrigerated storage

2.7 SDS-PAGE凝膠電泳分析

肌原纖維蛋白是組成肌肉中肌原纖維的蛋白質(zhì),其中肌球蛋白占蛋白質(zhì)總量的54%,肌動(dòng)蛋白占蛋白質(zhì)總量的20%～25%,還有原肌球蛋白、肌原蛋白和少量功能不明的調(diào)節(jié)性結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。隨著貯藏時(shí)間的增加,大分子量蛋白會(huì)逐漸水解為小分子量,SDS-PAGE凝膠電泳擇能夠顯示肌原纖維蛋白水解情況。如圖9所示,不同處理組間蛋白質(zhì)均出現(xiàn)了一定程度的降解,在分子量為97.4 kDa時(shí),只有復(fù)合組出現(xiàn)條帶,說明復(fù)合涂膜處理后的中國對(duì)蝦中依然存在較大分子量的蛋白。在43 kDa分子量的肌動(dòng)蛋白條帶中,第四泳道的復(fù)合組顏色最深,其次是殼聚糖組,說明經(jīng)過此兩種處理方法后的中國對(duì)蝦中肌動(dòng)蛋白含量較多,水解程度低。在31 kDa分子量處,前三種處理方式之間區(qū)別不大,但都條帶清晰,復(fù)合組顏色最深,說明貯藏10 d后經(jīng)過四種處理方法的中國對(duì)蝦中均含有一定量的原肌球蛋白,復(fù)合組含量最多。而在14.4 kDa處,空白組條帶最明顯,說明空白組中更多的蛋白質(zhì)被水解成小分子量蛋白?？傮w來看,復(fù)合涂膜組效果最明顯,能夠有效地抑制蛋白質(zhì)降解情況。

圖9 中國對(duì)蝦纖維蛋白SDS-PAGE電泳圖譜Fig.9 SDS-PAGE electrophoresis patterns of fibrin from Chinese shrimp注:M:Maker;1:空白處理;2:殼聚糖涂膜處理;3:ε-聚賴氨酸處理;4:復(fù)合涂膜處理。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,經(jīng)過單獨(dú)涂膜和復(fù)合涂膜處理的中國對(duì)蝦在冷藏過程中,其菌落總數(shù)、pH、TBA值、TVB-N含量和質(zhì)構(gòu)特性等指標(biāo)均明顯低于空白對(duì)照組,感官評(píng)分也具有較好的效果。涂膜處理可以有效的抑制細(xì)菌生長,減緩蛋白質(zhì)分解和脂肪氧化的速度,其中,復(fù)合涂膜處理組比單獨(dú)涂膜處理效果更好,與空白組相比可將中國對(duì)蝦的貨架期延長4 d。因此復(fù)合涂膜處理在中國對(duì)蝦的保鮮中具有良好的應(yīng)用前景。

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