劉春菊， 王海鷗， 唐明霞， 李大婧， 劉春泉， 張鐘元， 江 寧， 牛麗影， 袁春新

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇南京 210014； 2.國(guó)家蔬菜加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)分中心，江蘇南京 210014；3.南京曉莊學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院，江蘇南京 211171； 4.江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇如皋 226541)

黃秋葵[Abelmoschusesculentus(L.) Moench]是錦葵科秋葵屬一年生草本植物，被譽(yù)為素菜之王，富含蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及多糖、黃酮、果膠、鋅和硒等功能成分，具有抗氧化、防止衰老、抗腫瘤、降血脂等作用，具有較高的食用價(jià)值和藥用價(jià)值[1-3]。隨著黃秋葵的特殊食用、藥用功效日漸被人們認(rèn)識(shí)和了解，受到了許多專家學(xué)者的極大關(guān)注，其中在黃秋葵多糖和黃酮方面的研究表現(xiàn)得尤為突出。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，黃秋葵中含有一種黏性多糖，它是由阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖等構(gòu)成的多糖與蛋白質(zhì)形成的共價(jià)復(fù)合物，具有助消化、增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、降血脂等功效[4-5]。黃秋葵還富含黃酮類化合物，黃酮類物質(zhì)是公認(rèn)的天然抗氧化劑，具有降脂、抗心血管疾病、消除自由基以及抗氧化、抗骨質(zhì)疏松、防癌抗癌等作用[6]。

植物中多糖和黃酮類化合物的提取方法主要包括沸水浸提法、微波輔助提取法、超聲輔助提取法。近年來(lái)，微波、超聲輔助提取技術(shù)在植物有效成分提取方面的應(yīng)用廣泛，超聲波可利用其空化效應(yīng)加快介質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)速度，從而使可溶性活性成分迅速溶出[7]。微波輔助提取主要利用介電加熱和離子傳導(dǎo)作用，即利用離子在微波作用下的劇烈運(yùn)動(dòng)，使物質(zhì)中的成分溢出，從而達(dá)到快速提取的目的。微波、超聲輔助提取都具有溶劑用量少、提取時(shí)間短、提取溫度低等優(yōu)點(diǎn)[8]，但一般都是單獨(dú)輔助提取1種有效成分，聯(lián)合2種技術(shù)提取2種以上有效成分的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，因此，本研究以黃秋葵老蒴果為原料，采用微波-超聲輔助技術(shù)聯(lián)合提取黃秋葵中的多糖和黃酮，研究微波提取料液比、微波提取功率、微波提取時(shí)間、超聲提取乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲提取料液比、超聲提取功率、超聲提取溫度、超聲提取時(shí)間對(duì)黃秋葵多糖和黃酮得率的影響，以期為黃秋葵功能活性物質(zhì)的綜合提取提供技術(shù)支撐和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

黃秋葵品種為卡里巴，于2016年10月采自南通盛泰農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司黃秋葵種植基地，選取不能食用的黃秋葵老蒴果作為試驗(yàn)樣品。

1.2 儀器與試劑

UV-6300型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司)；BS224S電子分析天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器公司)；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)(湖南長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；WP800SL23-2格蘭仕微波爐(佛山市順德區(qū)格蘭仕微波爐電器有限公司)；KQ-S1000VDE型三頻數(shù)控超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)；真空冷凍干燥機(jī)(江蘇博萊客冷凍科技發(fā)展有限公司)；FW100高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)；HH-8恒溫水浴鍋(金壇市環(huán)保儀器廠)。葡萄糖、蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所；無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、蒽酮、硫酸等均為分析純。

1.3 黃秋葵凍干粉制備

當(dāng)天采摘的黃秋葵老蒴果經(jīng)過(guò)清洗、切片后，平鋪于物料盤(pán)上，將冷凍盤(pán)放入冷凍干燥設(shè)備中，當(dāng)物料溫度達(dá)到-30～-40 ℃時(shí)冷凍1～2 h，抽真空直至凍干倉(cāng)真空度達(dá)到30 Pa以下，打開(kāi)加熱板開(kāi)關(guān)，進(jìn)行真空冷凍干燥，待黃秋葵中心溫度與加熱板溫度一致時(shí)干燥結(jié)束。將凍干黃秋葵采用粉碎機(jī)研磨成粉，過(guò)80目篩，獲得黃秋葵凍干粉，置于-20 ℃環(huán)境中低溫保存。

1.4 微波-超聲聯(lián)合提取工藝

準(zhǔn)確稱取黃秋葵凍干粉0.20 g，以料液比1 g ∶100 mL加入蒸餾水混勻，用528 W微波功率提取4 min，每次20 s，中間停2 min，微波提取后離心，獲得上清液1和沉淀1。在上清液1中加入無(wú)水乙醇，使乙醇濃度達(dá)到80%，置于4 ℃冰箱中靜置過(guò)夜，離心后棄去上清液獲得沉淀2，取沉淀2用適量蒸餾水溶解，定容后獲得多糖提取液。向沉淀1中以料液比1 g ∶30 mL加入70%乙醇溶液，混勻后以超聲波功率 600 W，70 ℃超聲40 min，離心得到上清液2，然后用70%乙醇定容后獲得黃酮提取液。

1.5 多糖和黃酮測(cè)定方法

采用蒽酮-硫酸比色方法[9]測(cè)定多糖的含量；采用亞硫酸鈉-硝酸鋁分光光度方法[10]測(cè)定黃酮的含量。測(cè)得提取液多糖、黃酮含量后，按照式(1)計(jì)算多糖、黃酮得率：

(1)

式中：m1為多糖或黃酮提取液中多糖或黃酮含量，g；m為黃秋葵粉的質(zhì)量，g。

1.6 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

固定基本提取參數(shù)，分別考慮微波提取料液比(1 g ∶50 mL、1 g ∶75 mL、1 g ∶100 mL、1 g ∶125 mL、1 g ∶150 mL)、微波提取功率(136、320、528、680、760 W)、微波提取時(shí)間(2、3、4、5、6 min)、超聲提取乙醇體積分?jǐn)?shù)(50%、60%、70%、80%、90%)、超聲提取料液比(1 g ∶10 mL、1 g ∶20 mL、1 g ∶30 mL、1 g ∶40 mL、1 g ∶50 mL)、超聲提取功率(400、600、800、1 000 W)、超聲提取溫度(40、50、60、70、80 ℃)、超聲提取時(shí)間(20、30、40、50、60 min)。

1.7 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，由Tukey分析均值差異的顯著性，顯著水平0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波提取料液比對(duì)黃秋葵多糖、黃酮得率的影響

由表1可以看出，隨著料液比的增加，黃秋葵多糖得率整體呈增加趨勢(shì)，在料液比達(dá)到1 g ∶100 mL時(shí)多糖得率最高，為2.95%，料液比從1 g ∶50 mL增加到1 g ∶100 mL，多糖得率提高0.8倍，料液比繼續(xù)增加，多糖得率變化不顯著(P>0.05)，這可能是因?yàn)殡S著料液比的增加，黃秋葵中多糖的擴(kuò)散速度逐漸增大，提取液的黏度逐漸減小，對(duì)多糖的溶出起促進(jìn)作用[11]。此外，隨著蒸餾水添加量的增加，過(guò)多的蒸餾水使其他雜質(zhì)大量溶出，使多糖得率變化不大[9]。隨著料液比的增加，黃酮的得率逐漸下降，這可能是由于隨著微波提取料液比的增加，溶出的多糖得率增加，少量黃酮也會(huì)隨之溶出，造成沉淀中的黃酮量減少，導(dǎo)致黃酮得率逐漸降低。綜合考慮多糖得率和黃酮得率，將微波提取料液比確定為 1 g ∶100 mL 較為合適。

表1 微波提取料液比對(duì)黃秋葵多糖、黃酮得率的影響

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下表同。

2.2 微波提取功率對(duì)黃秋葵多糖、黃酮得率的影響

從表2可以看出，黃秋葵多糖得率整體上隨著微波功率的增大而增加，當(dāng)微波功率達(dá)到528 W后，隨著微波功率的繼續(xù)增大，多糖得率變化不顯著(P>0.05)，微波功率從 136 W 增大到528 W，多糖得率提高0.3倍，可能是由于微波輻射使得黃秋葵的細(xì)胞遭到破壞，多糖容易溶出，隨著微波功率的增大，溫度升高，分子的運(yùn)動(dòng)速度加快，部分多糖在高溫條件下發(fā)生水解[12]。黃酮得率隨著微波功率的增大而增加，這可能是由于微波功率增大對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的破壞，在超聲提取時(shí)可促使黃酮溶出量的增加[13]。因此，確定最佳微波提取功率為528 W。

表2 微波提取功率對(duì)黃秋葵多糖、黃酮得率的影響

2.3 微波提取時(shí)間對(duì)黃秋葵多糖、黃酮得率的影響

從表3可以看出，隨著微波提取時(shí)間的增加，黃秋葵多糖得率呈先增加后減少的變化趨勢(shì)，當(dāng)微波提取時(shí)間為4 min時(shí)，多糖得率達(dá)到最大值，提取時(shí)間繼續(xù)增加，多糖得率有所減少；隨著微波提取時(shí)間的增加，黃酮得率呈先增加后減少的變化趨勢(shì)，在提取時(shí)間為4 min時(shí)黃酮得率達(dá)到最大值，繼續(xù)增加提取時(shí)間，黃酮得率急劇下降，微波提取時(shí)間從2 min增加到4 min，多糖得率和黃酮得率都提高0.4倍。這可能是由于短時(shí)間內(nèi)的微波輻射對(duì)細(xì)胞的破碎作用較大，使得多糖溶出較多，較長(zhǎng)時(shí)間的微波輻射使多糖的穩(wěn)定性下降[14]，并且隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞破碎得更完全，其他物質(zhì)也同時(shí)被提取出來(lái)[15]。因此，微波提取時(shí)間為4 min時(shí)黃秋葵多糖、黃酮得率最高。

表3 微波提取時(shí)間對(duì)黃秋葵多糖、黃酮得率的影響

2.4 超聲提取乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃秋葵黃酮得率的影響

從表4可以看出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，黃秋葵黃酮得率先增加后減少，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，黃酮得率達(dá)到最大值，這與孫鮮明等從流蘇花中超聲提取總黃酮的研究結(jié)果[16]一致。這可能是由于黃酮類化合物具有較高的極性，乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加可使黃酮更好地溶出[13]。但當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過(guò)80%后，黃酮類化合物達(dá)到飽和，同時(shí)一些親脂性雜質(zhì)成分的溶出量增加，這些成分與黃酮類化合物競(jìng)爭(zhēng)性溶出，從而導(dǎo)致黃酮類化合物得率下降[17]。因此，最佳超聲提取乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%。

表4 超聲提取乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃秋葵黃酮得率的影響

2.5 超聲提取料液比對(duì)黃秋葵黃酮得率的影響

從表5可以看出，黃秋葵黃酮得率整體上隨著超聲提取料液比的增加而增加，當(dāng)料液比達(dá)到1 g ∶20 mL時(shí)，黃酮得率達(dá)到最大值，料液比從1 g ∶10 mL增加到1 g ∶20 mL，黃酮得率提高0.3倍，繼續(xù)增加料液比，黃酮得率變化不顯著(P>0.05)，這可能由于隨著料液比的增加，黃酮類物質(zhì)與乙醇溶液的接觸面積增大，從而使得黃酮類物質(zhì)可以充分溶解出來(lái)，但料液比的繼續(xù)增加，可使除了黃酮以外的雜質(zhì)也被溶解出來(lái)，對(duì)黃酮得率產(chǎn)生影響[15]。綜合考慮，確定的最佳超聲提取料液比為1 g ∶20 mL。

表5 超聲提取料液比對(duì)黃秋葵黃酮得率的影響

2.6 超聲提取功率對(duì)黃秋葵黃酮得率的影響

從表6可以看出，黃秋葵黃酮得率整體隨著超聲提取功率的增大而增加，在800 W時(shí)達(dá)到最大值，超聲功率從400 W增大到800 W，黃酮得率提高0.2倍，繼續(xù)增加超聲功率，黃酮得率變化不顯著(P>0.05)。這可能是由于隨著超聲功率的增大，黃秋葵細(xì)胞壁的破損程度增大，在800 W后黃秋葵中的細(xì)胞組織已全部破碎變形，黃秋葵中黃酮幾乎全部被提取出來(lái)，使得繼續(xù)增大提取功率時(shí)黃酮的提取率變化不顯著(P>0.05)。綜合考慮超聲提取功率為800 W較合適。

表6 超聲提取功率對(duì)黃秋葵黃酮得率的影響

2.7 超聲提取溫度對(duì)黃秋葵黃酮得率的影響

從表7可以看出，黃秋葵黃酮得率整體上隨著超聲提取溫度的升高先增加后減少，在溫度為70 ℃時(shí)達(dá)到最大值，提取溫度從40 ℃升高到70 ℃，黃酮得率提高0.4倍，繼續(xù)增加提取溫度，黃酮得率下降，這可能是由于黃酮在乙醇中的溶解度在一定范圍內(nèi)隨溫度的升高而增加，同時(shí)由于溫度逐漸升高，提取液黏度減小，擴(kuò)散系數(shù)增加，促使提取速度加快[18]，但過(guò)高的溫度容易使黃酮類化合物氧化，并且其他雜質(zhì)的溶出也會(huì)增多。因此，最佳超聲提取溫度為70 ℃。

表7 超聲提取溫度對(duì)黃秋葵黃酮得率的影響

2.8 超聲提取時(shí)間對(duì)黃秋葵黃酮得率的影響

從表8可以看出，黃秋葵黃酮得率整體上隨著超聲提取時(shí)間的增加而增加，在提取時(shí)間為50 min時(shí)達(dá)到最大值，提取時(shí)間從20 min增加到50 min，黃酮得率提高0.3倍，繼續(xù)增加超聲時(shí)間，黃酮得率變化不明顯。這可能是由于在一定范圍內(nèi)增加提取時(shí)間，可以使黃秋葵原料與乙醇的接觸時(shí)間增加，從而使黃酮在溶液中的溶解度增加，當(dāng)超聲時(shí)間超過(guò)50 min時(shí)，溶質(zhì)大量揮發(fā)，原料中的其他醇溶性物質(zhì)也會(huì)被溶解并提取出來(lái)，對(duì)黃酮的提取與測(cè)定產(chǎn)生影響[19]。因此，超聲提取時(shí)間為50 min較合適。

表8 超聲提取時(shí)間對(duì)黃秋葵黃酮得率的影響

3 結(jié)論

不同微波提取參數(shù)對(duì)黃秋葵多糖、黃酮得率具有明顯影響，其中黃秋葵多糖得率隨著微波提取料液比的增加整體呈增加趨勢(shì)，從1 g ∶50 mL增加到1 g ∶100 mL，多糖得率提高0.8倍；黃酮得率隨著微波提取料液比的增加而逐漸減少。黃秋葵多糖、黃酮得率整體上隨著微波提取功率的增大而增加，其中微波功率從136 W增加到528 W，多糖得率提高0.3倍。隨著微波提取時(shí)間的增加，黃秋葵多糖、黃酮得率先增加后減少，當(dāng)提取時(shí)間為4 min時(shí)，達(dá)到最大值。

不同超聲提取參數(shù)對(duì)黃秋葵黃酮得率影響明顯，隨著超聲提取乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，黃秋葵黃酮得率先增加后減少，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，黃酮得率達(dá)到最大值；黃秋葵黃酮得率整體上隨著超聲提取料液比的增加而增加，從料液比 1 g ∶10 mL 增加到1 g ∶20 mL，黃酮得率提高0.3倍；隨著超聲提取功率的增加，黃秋葵黃酮得率整體呈增加趨勢(shì)，超聲功率從400 W增加到800 W，黃酮得率提高0.2倍；隨著超聲提取溫度的增加，黃秋葵黃酮得率先增加后減少，當(dāng)溫度為 70 ℃ 時(shí)，黃酮得率達(dá)到最大值；隨著超聲提取時(shí)間的增加，黃秋葵黃酮得率整體呈增加趨勢(shì)，當(dāng)提取時(shí)間為50 min時(shí)，達(dá)到最大值。

微波-超聲聯(lián)合提取黃秋葵多糖和黃酮的最佳工藝：微波提取料液比為1 g ∶100 mL，微波提取功率為528 W，微波提取時(shí)間為4 min，超聲提取乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，超聲提取料液比為1 g ∶20 mL，超聲提取功率為800 W，超聲提取溫度為70 ℃，超聲提取時(shí)間為50 min。

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