趙 鋮， 楊占南， 羅世瓊， 邸勝娟， 胡 娟， 張曲玲

(1.貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550001； 2.貴州師范大學(xué)貴州省山地環(huán)境信息系統(tǒng)與生態(tài)環(huán)境保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng) 550001)

魚腥草(HouttuyniacordataThunb.)別稱折耳根，為三白草科蕺菜屬草本植物，新鮮全草或干燥的地上部分可入藥[1]，是傳統(tǒng)藥食兼用、極具開發(fā)潛力的中藥資源[2]，富含多種化學(xué)成分及蛋白質(zhì)、脂肪、維生素等營(yíng)養(yǎng)成分[3]，具有抗氧化、抗白細(xì)胞、抗突變、抗炎、促進(jìn)免疫系統(tǒng)等多種活性成分[4-6]，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫、抗病毒和抑癌等作用[7]及解熱、抗過(guò)敏等功效，臨床應(yīng)用非常廣泛[8-12]。然而，受生長(zhǎng)環(huán)境影響，魚腥草化學(xué)成分的代謝累積差異顯著，氣候等因素影響魚腥草化學(xué)成分的代謝累積已有大量文獻(xiàn)報(bào)道[13-16]，而對(duì)影響魚腥草化學(xué)組分累積的土壤環(huán)境因素研究知之甚少。土壤是中藥賴以生存的基礎(chǔ)，復(fù)雜的土壤生態(tài)系統(tǒng)直接影響中藥的生長(zhǎng)發(fā)育[17-20]，而中藥生長(zhǎng)發(fā)育又影響植物化學(xué)成分的代謝累積。因此，研究影響中藥化學(xué)成分代謝累積的土壤環(huán)境因素，對(duì)選擇適宜土壤、改善土壤條件，提高栽培中藥的產(chǎn)量和質(zhì)量具有重要意義。本試驗(yàn)選擇氣候條件及土壤類型一致的不同魚腥草樣地，測(cè)定其土壤養(yǎng)分、pH值、魚腥草揮發(fā)性成分，分析土壤養(yǎng)分、pH值與魚腥草揮發(fā)性成分的相關(guān)性，初步探討影響魚腥草揮發(fā)性成分累積的主要土壤因素，為提高魚腥草揮發(fā)性化學(xué)成分含量累積，實(shí)現(xiàn)魚腥草藥用價(jià)值及其商業(yè)應(yīng)用開拓更大、更新的發(fā)展空間。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

主要儀器有721型分光光度計(jì)(天津冠澤科技有限公司)、PHS-3E型pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)、GCMS-QP2010C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津公司)、Optima 5 300 V 型電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(鉑金埃爾默儀器有限公司)。主要試劑有α-蒎烯、樟烯、β-蒎烯、β-月桂烯、檸檬烯、桉葉醇、反-2-己烯醛、γ-松油烯、順-3-己烯乙酯、1-己醇、α-環(huán)氧蒎烷、順-3-己烯-1-醇、反-2-己烯-1-醇、癸醛、芳樟醇、乙酰龍腦、β-石竹烯、甲基正壬酮、龍腦、癸醇、丁香酚、2-十四酮、異植醇、植醇等標(biāo)準(zhǔn)品，均購(gòu)買于美國(guó)Sigma公司；其他試驗(yàn)藥品與試劑均為分析純。

1.2 采樣地概況

采樣地位于貴州省畢節(jié)地區(qū)黔西縣水壩村、馬場(chǎng)村、貓場(chǎng)村、綺陌村，屬亞熱帶濕潤(rùn)季風(fēng)氣候，年均氣溫為14.1 ℃，海拔為1 386～1 444 m，年平均降水量為1 436 mm，氣候類型一致(表1)；樣地為典型的緩坡丘陵地貌，野生魚腥草自然生長(zhǎng)3年以上，并形成一定的優(yōu)勢(shì)植物，群落內(nèi)無(wú)雜草，周圍有木本植物遮擋光照。

1.3 樣品采集

采樣時(shí)間為2015年8月。在采樣時(shí)挖取魚腥草新鮮植株，保持植株完整性，抖掉魚腥草根部松散土壤，收集黏附于根部的土壤；每個(gè)采樣點(diǎn)采3～5個(gè)土樣，每個(gè)土樣質(zhì)量約為500 g，混合土樣，除去動(dòng)、植物分解殘?jiān)任镔|(zhì)，按“四分法”收集土樣，并裝入樣品密封袋內(nèi)，同時(shí)將魚腥草新鮮植株裝于密封袋內(nèi)，快速運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室；將土壤樣品除去粗石沙，攤于室內(nèi)自然風(fēng)干，研碎，分別過(guò)孔徑0.15、2.00 mm的篩，分別置于樣品袋中，過(guò)0.15 mm篩的土壤用于分析土壤全量N、P、K和有機(jī)質(zhì)含量，過(guò)2.00 mm篩的土壤用于測(cè)定土壤有效N、P、K含量和pH值；將魚腥草剪下葉片，置于冰箱中4 ℃冷藏，用于測(cè)定魚腥草揮發(fā)性成分。

1.4 測(cè)定內(nèi)容與方法

1.4.1 土壤養(yǎng)分及pH值的測(cè)定 采用pH計(jì)測(cè)定土壤pH值；分別采用消煮處理-等量滴定法、過(guò)氧化氫-濃硝酸消煮-比色法、過(guò)氧化氫-濃硝酸消煮-火焰分光光度計(jì)測(cè)定全氮、全磷、全鉀含量；分別采用碳酸氫鈉浸提-等量滴定法、碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法、乙酸銨浸提-電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法測(cè)定堿解氮、有效磷、有效鉀含量[21]。

表1 魚腥草采樣地相關(guān)信息

1.4.2 魚腥草揮發(fā)性成分的測(cè)定[22-23]將魚腥草葉片剪碎成2 mm長(zhǎng)葉段，稱取0.200 0～0.250 0 g葉片置于螺紋樣品瓶中，加入1.9 mL二氯甲烷、0.1 mL內(nèi)標(biāo)溶液(萘)，密閉，靜置過(guò)夜；超聲提取30 min，離心，取上清液，置于冰箱中，待測(cè)。

氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometer，簡(jiǎn)稱GC-MS)條件：色譜柱為FactorFourTM：capillary column，VF-WAXms，30 m×0.25 mm×0.25 μm；載氣為氦氣，流速為1.10 mL/min，不分流進(jìn)樣，不分流時(shí)間為 0.5 min；進(jìn)樣口溫度為250 ℃；升溫程序?yàn)槠鹗紲囟?5 ℃保持3 min，以 5.6 ℃/min 升溫至100 ℃，保持1 min，再以 3.1 ℃/min 升溫至125 ℃，再以15 ℃/min升溫至230 ℃，保持10 min；離子源為電子轟擊離子源(electron impact ion source，簡(jiǎn)稱EI)，電壓為70 eV，離子源溫度為200 ℃；檢測(cè)電壓為 1.2 kV，接口溫度為270 ℃，延遲時(shí)間為5 min；定量模式為選擇性離子檢測(cè)(selected ion monitor，簡(jiǎn)稱SIM)，揮發(fā)性成分定量離子分別為α-蒎烯(93)、樟烯(93)、β-蒎烯(93)、月桂烯(69)、檸檬烯(68)、桉油精(108)、反-2-己烯醛(83)、γ-松油烯(136)、順-3-己烯乙酯(82)、正己醇(56)、α-環(huán)氧蒎烷(109)、順-3-己烯-1-醇(70)、反-2-己烯-1-醇(57)、癸醛(55)、芳樟醇(71)、乙酰龍腦(95)、β-石竹烯(133)、甲基正壬酮(58)、龍腦(95)、萘(128)、正癸醇(55)、2-十四酮(58)、丁香酚(164)、異植醇(71)、植醇(71)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；采用外標(biāo)法計(jì)算揮發(fā)性成分含量；采用SPSS 21.0分析揮發(fā)性成分和土壤養(yǎng)分的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同樣地魚腥草揮發(fā)性成分含量

由圖1、表2可見，魚腥草主要揮發(fā)性成分為α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯、1-己醇、順-3-己烯-1-醇、癸醛、β-石竹烯、甲基正壬酮、正癸醇、2-十四酮、植醇，含量分別為5.74～14.68、3.22～8.27、26.80～59.22、2.55～6.67、80.36～115.00、92.32～196.86、1.82～5.50、2.98～10.69、2.20～5.05、53.26～153.73、6.91～12.18 μg/g；不同樣地各揮發(fā)性成分含量存在差異，Y1葉片中的樟烯、檸檬烯、乙酰龍腦、2-十四烷酮含量與Y2、Y3、Y4間差異顯著，但Y2、Y3、Y4葉片中的樟烯、檸檬烯、乙酰龍腦、2-十四烷酮含量相互間差異不顯著；Y2、Y3葉片中的α-蒎烯含量顯著高于Y1、Y4，而Y2與Y3之間差異不顯著；Y1、Y4葉片中的β-蒎烯含量顯著低于Y2、Y3，而Y1與Y4、Y2與Y3之間差異不顯著；Y2葉片中的反-2-己烯醛含量顯著低于Y3、Y4，而與Y1差異不顯著，Y1、Y3、Y4之間的反-2-己烯醛含量也沒有顯著性差異；Y4葉片中的順-3-己烯乙酯含量顯著低于Y2，而與Y1、Y3之間差異不顯著；Y2葉片中的1-己醇含量顯著低于Y1、Y3、Y4，Y1、Y3、Y4間的1-己醇含量差異不顯著；Y1、Y2葉片中的葵醛含量顯著低于Y3、Y4，Y1與Y2、Y3與Y4間差異不顯著；Y1葉片中甲基正壬酮含量顯著低于Y2，而Y1或Y2與Y3、Y4間差異不顯著。

2.2 不同樣地土壤養(yǎng)分狀況

由表3可見，在測(cè)定指標(biāo)中魚腥草土壤的有機(jī)質(zhì)含量相對(duì)最高，在22.08～35.09 g/kg之間，平均為28.70 g/kg，這說(shuō)明土壤大部分養(yǎng)分主要是碳水化合物；有效磷含量相對(duì)最低，在14.47～28.05 mg/kg之間，平均為22.51 mg/kg；不同樣地之間的土壤養(yǎng)分含量存在差異，4個(gè)樣地土壤的全氮含量、全鉀含量、堿解氮含量、有效鉀含量相互間差異不顯著；YT1的全磷含量顯著低于YT2、YT3、YT4，而YT2、YT3、YT4之間差異不顯著；YT1的有機(jī)質(zhì)含量顯著低于YT2、YT3，YT3與YT2、YT3與YT4、YT1與YT4差異不顯著；YT1、YT3的有效磷含量顯著高于YT2，與YT4差異不顯著；YT1的pH值顯著高于YT2、YT4，而與YT3差異不顯著。

表2 不同樣地魚腥草揮發(fā)性成分含量

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。表3同。

表3 魚腥草不同樣地的土壤養(yǎng)分狀況

2.3 魚腥草揮發(fā)性成分與土壤養(yǎng)分的相關(guān)性

由表4可見，α-蒎烯與堿解氮、有效磷含量呈顯著正相關(guān)；β-蒎烯與有效鉀含量呈顯著正相關(guān)；β-月桂烯與堿解氮含量呈顯著正相關(guān)，與有效鉀含量呈顯著負(fù)相關(guān)；1-己醇、順-3-己烯-1-醇與有效磷含量呈顯著正相關(guān)；與pH值呈顯著負(fù)相關(guān)；癸醛與有效磷含量呈顯著正相關(guān)；β-石竹烯與堿解氮含量呈顯著正相關(guān)；甲基正壬酮與有效磷含量、pH值呈顯著正相關(guān)；2-十四酮與pH值呈顯著正相關(guān)；植醇與堿解氮含量呈顯著性正相關(guān)，與有效鉀含量呈顯著負(fù)相關(guān)。

表4 魚腥草主要揮發(fā)性成分與土壤養(yǎng)分的相關(guān)性分析

注：“*”表示在0.05水平上差異顯著。

2.4 土壤養(yǎng)分與魚腥草主要揮發(fā)性成分的因子分析

魚腥草土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、全鉀、堿解氮、有效磷、有效鉀含量及pH值主要影響魚腥草揮發(fā)性成分α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯、1-己醇、順-3-己烯-1-醇、癸醛、β-石竹烯、甲基正壬酮、正癸醇、2-十四酮、植醇含量，基于此進(jìn)行因子分析，通過(guò)KMO(kaiser-meyer-olkin)和Bartlett檢驗(yàn)，得到KMO值為0.608，統(tǒng)計(jì)顯著性值(P)為0.001，小于0.05，處于顯著水平。由表5可見，前3個(gè)公共因子的特征值均大于1，累積方差貢獻(xiàn)率為88.816%，說(shuō)明這3個(gè)公共因子是反映影響魚腥草主要揮發(fā)性成分含量信息的因子。由表6可見，各因子的負(fù)載值趨兩極分化，其具有一定的生物學(xué)意義；有效鉀、有效磷、pH值對(duì)第1公共因子起主要作用，方差貢獻(xiàn)率為64.296%；有機(jī)質(zhì)、堿解氮、全氮對(duì)第2公共因子起主要作用，方差貢獻(xiàn)率為 13.453%；全鉀、全磷對(duì)第3公共因子起主要作用，方差貢獻(xiàn)率為11.067%。這說(shuō)明影響魚腥草揮發(fā)性成分含量的土壤因子主要為有效磷、有效鉀、pH值，其次為有機(jī)質(zhì)、堿解氮、全氮，這和魚腥草揮發(fā)成分與土壤養(yǎng)分相關(guān)性的分析結(jié)果基本一致。

表5 土壤養(yǎng)分與魚腥草主要揮發(fā)性成分因子分析的特征值和累積貢獻(xiàn)率

表6 方差極大正交旋轉(zhuǎn)后的因子載荷矩陣

3 討論

通過(guò)土壤養(yǎng)分與魚腥草揮發(fā)性成分的相關(guān)性和因子分析，初步明確影響魚腥草主要揮發(fā)性成分的土壤因素是有效磷、有效鉀及土壤pH值。因此，在栽培魚腥草時(shí)可以根據(jù)對(duì)魚腥草揮發(fā)性成分含量要求，通過(guò)合理施肥適當(dāng)調(diào)整土壤的氮、磷養(yǎng)分比例，改善土壤pH值，以期達(dá)到提高魚腥草揮發(fā)性物質(zhì)的效果，這為魚腥草的人工種植提供了技術(shù)支持，也為魚腥草的質(zhì)量控制提供了一定的科學(xué)依據(jù)。

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