郝福星， 左偉勇， 劉 莉，2

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院/江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點實驗室，江蘇泰州 225300； 2.揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚州 225009)

弓形蟲病是由剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)引起的一種人獸共患寄生蟲病，宿主種類十分廣泛[1]。貓科動物是弓形蟲的終末宿主[2]，在貓體內(nèi)弓形蟲進行有性生殖產(chǎn)生卵囊，卵囊隨貓的糞便排出體外，并發(fā)育成具有感染性的孢子化卵囊，后者能夠感染人和大多數(shù)的溫血動物。人因與動物接觸、誤食了受弓形蟲卵囊污染的水源、土壤或食物(肉、蛋)，會引起弓形蟲感染[3]。據(jù)文獻報道，人和動物感染呈世界范圍內(nèi)分布，人群的平均感染率25%～50%，多呈隱性感染，推算全世界約1/4的人感染弓形蟲[4]；感染弓形蟲的動物種類很多，如家畜、家禽、鼠以及魚類，可引起豬、牛、羊、犬、雞等畜禽發(fā)病，可引起大批發(fā)病，死亡率高，給畜牧業(yè)生產(chǎn)造成嚴重經(jīng)濟損失[5-7]。而豬作為人類最主要的肉產(chǎn)品來源之一，檢測其弓形蟲感染狀況，在公共衛(wèi)生與食品安全方面意義重大[7]。因此，開展豬弓形蟲病的研究工作，對畜牧業(yè)發(fā)展和人類健康具有重要的經(jīng)濟價值和社會意義。

弓形蟲感染的診斷主要包括病原學(xué)檢測、免疫學(xué)診斷及分子生物學(xué)診斷技術(shù)[8]。病原學(xué)檢測方法有直接涂片與組織切片染色法，該法可對弓形蟲急性感染進行確診，但存在費時費力的缺點，對弓形蟲隱性感染的檢測效能不強；動物接種試驗和細胞培養(yǎng)法能夠直接確認病原體存在，但敏感性低、耗時、易漏診且難以應(yīng)用于實際操作。以間接血凝試驗(IHA)與酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)為主的免疫學(xué)診斷方法[9]具有特異性強、敏感性高、操作簡便等優(yōu)點，是弓形蟲病流行病學(xué)調(diào)查和診斷最常用的方法，但有報道顯示，臨床診斷中也存在假陽性，需要與其他診斷方法綜合判定[10]。以PCR為主的分子生物學(xué)診斷技術(shù)[11]具有靈敏度高的特點，但是因檢測樣本(如外周血)復(fù)雜與PCR技術(shù)本身等原因也存在假陽性高、準確性較差等缺點。因此，迫切需要建立一種準確性好、快速靈敏的檢測方法。

筆者利用MALDI-TOF質(zhì)譜結(jié)合ClinProTool分析在小鼠動物模型上已能成功對弓形蟲感染進行判定[12]。有文獻顯示，該方法在包括血吸蟲感染、腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病診斷中也有較廣泛的應(yīng)用[13]，具有高通量、靈敏度高、可重復(fù)性好及樣本需求量少等優(yōu)勢，本研究擬建立一種快速準確診斷豬弓形蟲感染的方法，對江蘇泰州部分地區(qū)豬場的弓形蟲感染情況做一調(diào)查，為當(dāng)?shù)刎i的養(yǎng)殖與防病提供重要的參考。

1 材料與方法

1.1 受試動物與試劑

江蘇省泰州市轄區(qū)(海陵、高港、姜堰)小型豬場(<100頭豬)育肥豬，共采集3個豬場，每個豬場采集50頭。

弓形蟲間接血凝試驗凍干抗原(IHA抗原，批號：20151011)；標準陽性血清、標準陰性血清、稀釋液(批號：20151011)，均購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所。MB-WCX磁珠純化試劑盒(美國Bruker Daltonic公司)，丙酮、甲醇、異丙醇、乙腈、三氟乙酸、甲酸等均為色譜純級?；|(zhì)：HCCA(α-氰-4-羥肉桂酸)，300 mg/L，溶于乙醇 ∶丙酮=2 ∶1，新鮮配制。

1.2 血清采集與分離

每頭豬行耳靜脈采血2～2.5 mL，將采集的新鮮血液，加入1.5 mL無菌EP管中，即刻置于4 ℃冰箱保存，待30 min后以12 000 r/min、4 ℃離心10 min，分離血清冷凍于-80 ℃冰箱待測。

1.3 弓形蟲IHA診斷方法

按照試劑說明書進行操作，即于96孔有機玻璃板加入75 μL稀釋液，每個待檢血清樣品加稀釋液4孔，取25 μL血清加入第一孔，混勻后吸取25 μL加入第二孔，以此類推，進行倍比稀釋。待檢血清加完后，每孔加入25 μL診斷液，將反應(yīng)板放至微量振蕩器上振蕩1～2 min，靜置于22～37 ℃恒溫箱中作用2～3 h后觀察結(jié)果。每批次均需設(shè)陽性對照與陰性對照。

1.4 血清肽質(zhì)譜檢測法

根據(jù)磁珠純化血清多肽試劑盒標準操作規(guī)程，將10 μL樣本結(jié)合液與10 μL磁珠試劑混合，與血清樣本10 μL混勻并室溫靜置5 min；將磁珠進行富集并棄上清，清洗磁珠后加洗脫液(ES)5 μL與磁珠混勻，室溫靜置5 min后置磁珠富集器并棄上清，最后加5 μL穩(wěn)定液(SS)至離心管并混勻，取 1 μL 與基質(zhì)10 μL完全混合，制成混懸液，取1 μL混懸液點靶，室溫干燥后上機檢測，設(shè)置MALDI-TOF-MS儀器參數(shù)，選擇LP-Clinprot.pa方法，靶MTP_polished steel 384，激光能量在40%左右，檢測分子量范圍為m/z800～12 000；應(yīng)用flexanalysis與Clin ProTools軟件對采集圖譜進行分析，應(yīng)用MASCOT數(shù)據(jù)庫對差異多肽峰進行初步搜庫鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 血清間接血凝試驗結(jié)果

根據(jù)IHA陽性結(jié)果標準，在陽性對照血清效價不低于 1 ∶1 024，陰性對照孔血清除第1孔允許有前滯現(xiàn)象“+”外，其余各孔及對照孔均為“?”的前提下，對被檢血清進行判定，被檢血清抗體效價達到或超過1 ∶64為陽性。結(jié)果顯示，本研究采集的泰州市轄區(qū)(海陵、高港、姜堰)3個小型豬場的150頭份血清樣本中陽性血清為25份，陽性率為16.67%(表1)。

表1 泰州部分地區(qū)豬弓形蟲感染情況調(diào)查(IHA法)

2.2 血清多肽指紋圖譜分析

將25份IHA陽性血清與125份陰性血清分別歸為感染組與對照組，利用磁珠純化血清多肽，并與基質(zhì)混勻后點靶進行質(zhì)譜檢測。結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，IHA陽性組豬血清中在m/z1 608.59、1 971.84、5 004.01、4 617.49、7 808.23的5個多肽峰的表達顯著上調(diào)，而m/z1 233.01、8 007.66、2 356.37、3 735.65的4個峰呈顯著下調(diào)(表2)。

表2 豬弓形蟲感染組與對照組血清差異表達多肽(ClinProTool法)

注：“*”表達上調(diào)，“**”表達下調(diào)。

2.3 弓形蟲檢測方法的建立與驗證

將血清多肽指紋圖譜導(dǎo)入Clin ProTools軟件，并將IHA陽性血清與陰性血清進行分組，尋找并依據(jù)組間譜圖差異，建立豬的弓形蟲感染診斷方法，為驗證診斷方法的敏感性與特異性，將陽性與陰性血清指紋圖譜導(dǎo)入，質(zhì)譜可自動化判定，結(jié)果顯示，25份IHA陽性血清可以成功被質(zhì)譜診斷模型判定為弓形蟲感染，敏感性達100%，而125份陰性血清中有119份可被判定為未感染，準確性達95.2%(119/125)，另6份不能判定。

3 結(jié)論與討論

豬弓形蟲病呈世界范圍流行，我國分布十分廣泛，食入貓糞便中的卵囊、通過損傷的黏膜與皮膚、母豬孕期經(jīng)胎盤感染仔豬，均為本病的感染途徑[14]。規(guī)?；F(xiàn)代化的養(yǎng)殖方式雖可以避免傳統(tǒng)粗放養(yǎng)殖中的寄生蟲感染情況，如疥螨和蛔蟲等感染率得以大大降低，但畜牧場外部環(huán)境、豬群內(nèi)部引進和繁殖等一系列環(huán)節(jié)的存在，使得弓形蟲仍然有較高的感染機會，甚至呈暴發(fā)流行[15]，而弓形蟲作為人獸共患寄生蟲病，禽、犬、貓等多種動物均可攜帶[16]，對公共衛(wèi)生威脅更大，有必要對該病進行重點防控。有報道顯示，部分豬場發(fā)病率可高達60%以上[17]，病死率可高達64%。隨著養(yǎng)殖水平提高，該病在我國多呈隱性感染，一旦疏于防范，有可能造成弓形蟲病的流行和暴發(fā)，因此，對規(guī)?；B(yǎng)殖豬場尤其要加強該病的監(jiān)測。相比傳統(tǒng)的檢測方法，血清多肽指紋圖譜檢測法具有高通量、檢測效率高的優(yōu)勢，且在實驗小鼠[18]、家兔[19]等動物已成功建立了寄生蟲病的診斷方法，在豬的弓形蟲感染診斷中，還較少見報道。

MALDI-TOF質(zhì)譜結(jié)合Clin ProTools軟件分析，可以將弓形蟲感染與未感染豬血清中的多肽進行區(qū)別，并以血清差異表達多肽建立診斷方法，對該方法的驗證結(jié)果顯示，與傳統(tǒng)的IHA方法一致，可以用于豬感染弓形蟲的診斷與早期篩查。本研究采用的質(zhì)譜檢測法，可以在30～60 min內(nèi)實現(xiàn)384個樣本的檢測，具有高通量、快速、自動化程度高等特點，且血清樣本需求量為傳統(tǒng)IHA實驗的1/20，很大程度上減少受試豬的失血量。對血清差異表達多肽的檢測與MASCOT搜庫分析顯示，與筆者之前的研究比較，m/z1 971.84、5 004.01 同樣出現(xiàn)在弓形蟲感染的小鼠與本研究選取的IHA陽性豬血清中，經(jīng)二級質(zhì)譜鑒定，該2種多肽分子可能為弓形蟲表面膜蛋白的片段，有望成為弓形蟲感染動物的指征性分子。ClinProTools分析顯示，利用豬血清中9個差異性多肽峰建立診斷方法，其敏感性與準確性較高，該方法以多個差異多肽作為判斷指標，其準確性要優(yōu)于單一指標，且血清多肽檢測方法是建立在群體基礎(chǔ)上，更好地規(guī)避了個體差異，在同組血清樣本中能夠最大限度地體現(xiàn)共性，可重復(fù)性強。因此，該方法有望成為判定豬弓形蟲感染狀況的輔助篩查手段。

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