于連鵬， 張亞玲，3，4， 劉殿宇， 周弋力， 國寶煥， 靳學(xué)慧，3，4

(1.植保資源與無公害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)基礎(chǔ)實驗室，黑龍江大慶 163319； 2.黑龍江省植物抗性研究中心，黑龍江大慶 163319；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，黑龍江大慶 163319； 4.國家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江大慶 163319)

稻瘟病是水稻主要病害之一，由稻梨孢[無性態(tài)Pyriculariagrisea(Cooke)Sacc，有性態(tài)PyriculariaoryzaeCav]侵染引起[1]。據(jù)報道，全球每年因稻瘟病造成的水稻產(chǎn)量損失約占總產(chǎn)量的10%～30%，經(jīng)濟損失達(dá)數(shù)十億美元。目前，防治稻瘟病的主要途徑是化學(xué)防治和選育抗病品種[2]，化學(xué)防治雖直接有效，但長期使用化學(xué)農(nóng)藥易使病害產(chǎn)生抗藥性，并對環(huán)境和糧食造成污染；種植抗病品種及水稻品種合理布局是防治稻瘟病最經(jīng)濟、有效、安全的措施，但由于稻瘟病病菌生理小種復(fù)雜且變異頻繁，直接導(dǎo)致水稻抗病品種在大面積推廣種植3～5年后喪失抗病性，引起稻瘟病暴發(fā)流行[3]。因此，鑒定水稻品種的抗瘟性，對篩選新的抗病良種、保證水稻高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)具有重要意義。在過去的幾十年中，國內(nèi)外專家學(xué)者相繼鑒定出Moroberekan、Dourode Perecose、OS6、IR36、IR42、Milyang30、Tetep、三黃占2號、梅三五2號、谷梅2號、湘資3150等具有稻瘟病廣譜或持久抗性的種質(zhì)資源[4]。朱小源等于2001—2005年對廣東省154個水稻品種進行了多點田間稻瘟病自然誘發(fā)抗性鑒定，發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)為中抗及以上的品種有75個，占48.70%[5]。韋燕萍等從1 500份普通野生稻中鑒定出38份抗稻瘟病材料，在113份藥用野生稻中發(fā)現(xiàn)18份抗稻瘟病材料[6]。王桂玲等于2006—2010年，對黑龍江省274份水稻品種進行稻瘟病人工接種鑒定，對穗頸瘟表現(xiàn)抗病的有152份水稻品種[7]。黑龍江省是我國粳稻的主產(chǎn)區(qū)，2015年水稻種植面積達(dá)400萬hm2，是我國重要的水稻糧食生產(chǎn)基地[8]。稻瘟病是長期威脅水稻生產(chǎn)的主要因素，也是影響黑龍江省水稻高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的限制性因素之一。本研究利用2014年從黑龍江省5個水稻種植區(qū)的20個縣(市、區(qū))采集分離的180個稻瘟病病菌菌株，對2015年黑龍江省主栽水稻品種進行抗病性接種鑒定，以蒙古稻作為感病對照品種[9]，通過對抗性頻率和聯(lián)合抗病性系數(shù)(pathogenicity association coefficient，簡稱RAC)的研究，來明確黑龍江省主栽水稻品種的抗性，以期為黑龍江省各稻區(qū)合理利用抗病品種來防治稻瘟病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗時間、地點

試驗于2016年在黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生物技術(shù)中心作物抗性分子生物研究室進行。

1.2 供試水稻品種

供試品種為黑龍江省主栽的23個水稻品種，分別是綏粳4、龍慶稻3、墾稻12、五優(yōu)稻4號、綏粳8、龍洋16、粘稻、龍粳29、龍粳31、龍粳42、龍粳43、稻花香2號、松粳3、松粳9、松粳15、松粳20、吉粳88、空育131、龍粳40、北稻4、龍粳21、龍洋1號、中龍粳1號，感病對照品種是蒙古稻，均由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)作物抗性分子生物研究室提供。

1.3 稻瘟病病菌菌株

供試菌株是筆者所在實驗室于2014年分離保存的180個菌株，其中包括綏化種植區(qū)24個菌株，大慶種植區(qū)67個菌株，齊齊哈爾種植區(qū)26個菌株，蘿北種植區(qū)9個，哈爾濱種植區(qū)54個菌株。

1.4 供試培養(yǎng)基

生長培養(yǎng)基[馬鈴薯葡萄糖(PDA)培養(yǎng)基]配方：200 g 去皮馬鈴薯，20 g葡萄糖，15 g瓊脂，1 000 mL蒸餾水，pH值自然[10]。

產(chǎn)孢培養(yǎng)基：采用米糠培養(yǎng)基作為稻瘟病病菌的產(chǎn)孢培養(yǎng)基[11]。分別稱取10.0 g米糠，1.0 g酵母浸粉、5.5 g瓊脂粉，放入準(zhǔn)備好的1 000 mL三角瓶中，再加入500 mL水，混勻后塞上膠塞，將制備好的米糠培養(yǎng)基放入高壓滅菌鍋中，在120 ℃高壓滅菌30 min后取出，備用。

1.5 育苗與接種

育苗營養(yǎng)液：采用經(jīng)典的Hoagland’s營養(yǎng)液，配方為 945.0 mg/L 四水硝酸鈣、506.0 mg/L硝酸鉀、80.0 mg/L硝酸銨、136.0 mg/L磷酸二氫鉀、493.0 mg/L七水硫酸鎂、2.5 mL 鐵鹽溶液、5.0 mL微量元素液，pH值為6.0。其中，鐵鹽溶液配方：2.78 g七水硫酸亞鐵、3.73 g乙二胺四乙酸二鈉、500 mL 蒸餾水，pH值為5.5；微量元素液配方：0.830 mg/L碘化鉀、6.200 mg/L硼酸、22.300 mg/L硫酸錳、8.600 mg/L硫酸鋅、0.250 mg/L鉬酸鈉、0.025 mg/L硫酸銅、0.025 mg/L氯化鈷[12]。

育苗：采用室內(nèi)水培法，選擇健康飽滿的水稻種子，參考陳夕軍等的方法[13]，取1.25 g 50%多菌靈加入1 000 mL水中，在此浸種48 h后撈出，然后用清水清洗后置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中催芽8 h。水培稻苗采用連兆煌的方法[12]，播種于固定在塑料水培盒內(nèi)的定植籃中，每個定植籃播種10粒種子，自來水培養(yǎng)3 d后，再用營養(yǎng)液培養(yǎng)，每4 d更換1次營養(yǎng)液，待秧苗長至3葉1心期時進行接種。

產(chǎn)孢培養(yǎng)及孢子懸浮液的制備：采用周燕等的方法[14]，略有改進，參試菌株在PDA培養(yǎng)基上活化，待長出菌落后移至米糠培養(yǎng)基中，每個菌株移5皿，培養(yǎng)10 d，待菌絲長滿培養(yǎng)皿后，刮除氣生菌絲，打開培養(yǎng)皿蓋，平置于滅菌后的產(chǎn)孢培養(yǎng)箱內(nèi)，用紫光燈照射，2 d后即可產(chǎn)生孢子。每個培養(yǎng)皿用 20 mL 無菌水洗下孢子，紗布過濾，顯微鏡下檢測，接種孢子懸浮液濃度為100倍顯微鏡下每個視野20～40個孢子，每個秧盤的稻瘟病病菌孢子懸浮液的接種量為100 mL，放入小噴壺中，于冰浴下保存用于接種。

接種：采用張亞玲等的方法[15]，待秧苗長至3葉1心期時，向制備好的菌株孢子懸浮液中加入5 mL明膠溶液(1 g明膠加入10 mL水)。搖勻后均勻地噴在葉片表面，直至葉片完全布滿小水珠為止。接種后移入水培架內(nèi)，于26 ℃持續(xù)噴水保濕48 h，以利于發(fā)病。

1.6 病情調(diào)查與評價

接種7 d后調(diào)查病情，調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)參照表1中稻瘟病病情調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)[16]，分級記載發(fā)病情況。試驗中水稻品種對稻瘟病的抗性通過品種抗性頻率和RAC來評價[17]，當(dāng)某個品種抗性頻率≥80%時，記為R；80%>抗性頻率≥60%時，記為MR；60%>抗性頻率≥40%時，記為MS；抗性頻率<40%時，記為S[18]。1、2分別指品種1、品種2，(R1與R2)表示對品種1、品種2的致病性均強，具體評價方法參考何月秋等的方法[19]?？剐灶l率=(抗性為R、MR的菌株數(shù)量/供試菌株總數(shù))×100%；聯(lián)合抗病性系數(shù)1、2=[(R1與R2)菌株數(shù)量/供試菌株總數(shù)]×100%。

表1 稻瘟病病情調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果與分析

2.1 供試品種對供試菌株的抗性頻率

由表2可知，23個黑龍江省主栽水稻品種對供試菌株的抗性總體表現(xiàn)較好，平均抗性頻率為78.03%，在參試的不同品種之間抗性頻率有差異，抗性頻率最低的是龍粳21，最高的是龍粳42，所有主栽品種對供試菌株的抗性頻率均高于50%。其中，11個品種的綜合抗性評價表現(xiàn)為R，占總數(shù)的47.8%，11個品種的綜合抗性評價表現(xiàn)為MR，占總數(shù)的 47.8%。龍粳42的抗性頻率最高，達(dá)98.3%，其次是龍粳40、龍粳31、龍粳43，抗性頻率分別為97.8%、95.0%、95.0%，這4個品種的抗性頻率均大于或等于95.0%，抗性較強，綜合抗性評價表現(xiàn)為抗病(R)；而抗性頻率最低的龍粳21，其抗性頻率為56.2%，綜合抗性評價表現(xiàn)為中度感病(MS)。

2.2 水稻品種對不同地區(qū)菌株的抗性分析

由表3可知，供試的水稻品種對黑龍江省綏化、大慶、齊齊哈爾、蘿北、哈爾濱等5個地區(qū)分離的菌株抗性表現(xiàn)有較大的差異，由抗性頻率可知綜合抗性評價分別表現(xiàn)為MR、MR、R、R、R。供試水稻品種對齊齊哈爾、蘿北、哈爾濱等地區(qū)的菌株抗性頻率較高，分別為89.4%、95.4%、90.4%，對綏化和大慶地區(qū)的菌株抗性頻率較低，分別為72.3%、60.5%。供試品種中綏粳8、龍粳31、龍粳42、龍粳43、龍粳40、北稻4等對5個地區(qū)的菌株抗性均表現(xiàn)為抗(R)。粘稻、龍粳21、龍洋1號、中龍粳1號、綏粳4等對綏化市菌株的抗性均表現(xiàn)為中感(MS)，其余品種對綏化市菌株的抗性表現(xiàn)為抗(R)或中抗(MR)。墾稻12、粘稻、松粳9、松粳15、龍粳21、龍洋1號、中龍粳1號等對大慶市菌株的抗性均表現(xiàn)為感(S)，松粳3對大慶市菌株的抗性表現(xiàn)為中感(MS)，其余品種對大慶市菌株的抗性表現(xiàn)為抗(R)或中抗(MR)。供試的23個水稻品種對齊齊哈爾市、蘿北縣、哈爾濱市等地區(qū)的菌株的抗性表現(xiàn)為抗(R)或中抗(MR)。

表2 黑龍江省主栽水稻品種對供試菌株的抗性頻率分析

表3 水稻品種對不同地區(qū)分離的菌株抗性綜合評價

2.3 水稻品種聯(lián)合使用抗瘟性可利用價值評價

稻瘟病的防治最經(jīng)濟有效的方法是合理利用抗病品種，做好品種的合理布局。為了明確品種聯(lián)合種植后的抗性表現(xiàn)，本研究利用聯(lián)合抗病性系數(shù)來評價品種組合的利用價值。由表4可知，RAC<0.4的有1對水稻組合，占所有調(diào)查品種組合的0.4%，0.4≤RAC<0.5的有26對，占所有調(diào)查組合的10.3%，0.5≤RAC<0.6的有92對，占所有調(diào)查組合的36.4%，0.6≤RAC<0.7的有65對，占所有調(diào)查組合的 25.7%，0.7≤RAC<0.8的有45對，占所有調(diào)查組合的 17.8%，0.8≤RAC<0.9的有18對，占所有調(diào)查組合的 7.1%，RAC≥0.9的有6對，占所有調(diào)查組合的2.4%。各品種之間聯(lián)合抗病性系數(shù)有差異，RAC最高為0.96，是龍粳42與龍粳40組合，最低為0.39，是龍粳21與龍粳29組合；龍粳31、龍粳40、龍粳42與龍粳43組合種植時的RAC均高于0.90，其中龍粳42與龍粳40搭配種植時的RAC最高。龍粳21與綏粳4、龍慶稻3、墾稻12、粘稻、龍粳29、稻花香2號、松粳3、松粳9、松粳15、吉粳88、空育131、龍洋1號、中龍粳 1號等組合種植時的RAC均低于0.50，其中龍粳21與龍粳 29組合種植時的RAC最低。

3 結(jié)論與討論

本試驗的結(jié)果是在室內(nèi)育苗接種下水稻品種表現(xiàn)出來的抗性，在接種后其環(huán)境條件有利于稻瘟病的發(fā)生，能表現(xiàn)出品種的真實抗性。在自然條件下稻瘟病的發(fā)病受環(huán)境影響較大，只有在有利于稻瘟病發(fā)生的條件下，品種的抗性才能真實地表現(xiàn)出來。本試驗采用水稻室內(nèi)苗期保濕接種的方法有利于稻瘟病的發(fā)生，更能明確水稻品種的真實抗性，通過對水稻品種抗性頻率和聯(lián)合抗病性系數(shù)的調(diào)查，篩選出抗性較強的水稻品種和品種組合，可以為有針對性地對水稻品種合理布局及區(qū)域抗稻瘟病育種提供堅實的理論基礎(chǔ)。

本研究采用離體接種法檢測23個水稻品種對180個菌株的稻瘟病抗性，在評價品種抗性方面，首先用抗性頻率來評價。研究結(jié)果表明，參試的23個品種抗性頻率差異較大，參試的水稻品種對稻瘟病病菌菌株的抗性總體表現(xiàn)不高，且有差異，平均抗性頻率為78.03%，抗性頻率最低的是龍粳21，最高的是龍粳42，差距達(dá)1.75倍，這與馬軍韜等研究的結(jié)果[20]類似。供試品種龍粳42、龍粳40、龍粳31、龍粳43等的抗性較強，綜合表現(xiàn)為抗病，可以在黑龍江省推廣種植，龍粳21等的抗性頻率相對較低，綜合表現(xiàn)為中度感病，對這些品種的推廣種植應(yīng)慎重。粘稻、中龍粳1號可以在哈爾濱、蘿北、齊齊哈爾等地區(qū)種植，在綏化和大慶地區(qū)生產(chǎn)上要慎重使用。

通過對水稻品種聯(lián)合抗病性系數(shù)的調(diào)查分析，發(fā)現(xiàn)大部分水稻品種組合的聯(lián)合抗病性系數(shù)都高于0.50，有22對水稻品種的聯(lián)合抗病性系數(shù)大于0.80，占所有調(diào)查組合的8.7%，其中有6對高于0.90，27對水稻品種低于0.50，占所有調(diào)查組合的10.7%。龍粳21與龍粳29的聯(lián)合抗病性系數(shù)最低，為0.39，在生產(chǎn)上不建議推廣種植，龍粳31、龍粳40、龍粳42、龍粳43兩兩聯(lián)合種植的聯(lián)合抗病性系數(shù)都高于0.90，建議在生產(chǎn)上推廣種植。本研究通過RAC進行分析可以提供品種組合對稻瘟病病菌株聯(lián)合抗病性的較全面的資料，特別是在抗性親本的選擇和分析品種的抗性遺傳背景相似性方面，具有實際的應(yīng)用價值和理論意義。

稻瘟病是世界普遍發(fā)生的水稻病害，實踐證明選育和利用抗病品種是控制稻瘟病最經(jīng)濟有效的方法之一[21-24]。稻瘟病的抗性評價是選育和種植水稻品種的重要依據(jù)，本研究通過研究黑龍江省主栽的水稻品種對稻瘟病的抗性鑒定和評價，明確了黑龍江省水稻品種抗稻瘟病的現(xiàn)狀，對水稻品種的選育和布局提供了理論依據(jù)，已達(dá)到最大限度地減輕稻瘟病的發(fā)生流行。

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表4 水稻品種組合的聯(lián)合抗病性系數(shù)

注：1為綏粳4，2為龍慶稻3，3為墾稻12，4為五優(yōu)稻4號，5為綏粳8，6為龍洋16，7為粘稻，8為龍粳29，9為龍粳31，10為龍粳42，11為龍粳43，12為稻花香2號，13為松粳3，14為松粳9，15為松粳15，16為松粳20，17為吉粳88，18為空育131，19為龍粳40，20為北稻4，21為龍粳21，22為龍洋1號，23為中龍粳1號；對角線左下方數(shù)據(jù)為聯(lián)合抗病性系數(shù)。

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