陳 爽， 趙 晨， 黎 琪， 王 超， 張曉琳， 張?jiān)迄i， 李金萍， 方 俊

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙 410128； 2.國家糧食局科學(xué)研究院，北京 100037； 3.北京市植物保護(hù)站，北京 100029)

丁烯基多殺菌素(butenyl-spinosyns)[1-3]是由土壤放線菌須糖多孢菌(Saccharopolysporapogona)代謝產(chǎn)生的一類與多殺菌素結(jié)構(gòu)類似、殺蟲機(jī)制相同的大環(huán)內(nèi)酯類殺蟲劑[4-5]。其殺蟲譜比多殺菌素更為廣泛，對多殺菌素?zé)o法控制的煙青蟲[6]、蘋果蠹蛾、馬鈴薯甲蟲等均有較好的殺蟲活性[7-9]。其殺蟲機(jī)制與多殺菌素相同，通過作用于昆蟲的神經(jīng)系統(tǒng)，致其非功能性的肌肉收縮、衰竭，并伴隨顫抖和麻痹，最終導(dǎo)致死亡[10-12]。此外，丁烯基多殺菌素比多殺菌素具有更多的衍生物，到目前為止，已檢測到30多種丁烯基多殺菌素衍生物[1]，丁烯基多殺菌素作為一種新型的生物農(nóng)藥在防治害蟲方面有良好的應(yīng)用價(jià)值和廣闊的市場前景。

通過理化誘變篩選丁烯基多殺菌素高產(chǎn)菌株和培養(yǎng)基優(yōu)化是提高其發(fā)酵產(chǎn)量的主要方法[13]。目前，常規(guī)的誘變選育方法仍然是獲得高產(chǎn)菌株的有效手段之一[14-15]，其中亞硝基胍(nitroso-guanidin，簡稱NTG)是一種超誘變劑，應(yīng)用廣泛，能與1個(gè)或幾個(gè)核酸堿基反應(yīng)，引起DNA復(fù)制時(shí)堿基配對的轉(zhuǎn)換而發(fā)生遺傳變異[16]。本研究利用NTG對前期篩選到的ASAGF58菌株進(jìn)行誘變，擬篩選丁烯基多殺菌素穩(wěn)定高產(chǎn)突變株，并通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對高產(chǎn)突變株的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得高產(chǎn)丁烯基多殺菌素的配方。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 須糖多孢菌(S.pogona)ASAGF58由國家糧食局科學(xué)研究院發(fā)酵生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室篩選和保藏。

1.1.2 生測幼蟲 埃及伊蚊(Aedesaegypti)由中國疾病預(yù)防控制中心提供。

1.1.3 培養(yǎng)基 產(chǎn)孢培養(yǎng)基：10.00 g/L葡萄糖，5.00 g/L酪蛋白胨，5.00 g/L酵母提取物，5.00 g/L牛肉膏，0.74 g/L CaCl2·2 H2O，15.00 g/L瓊脂，pH值為7.2。誘變種子培養(yǎng)基：30.0 g/L胰蛋白大豆肉湯，3.0 g/L酵母提取物，2.0 g/L MgSO4，10.0 g/L葡萄糖，pH值為7.2。誘變發(fā)酵培養(yǎng)基：64.80 g/L 葡萄糖，54.60 g/L糊精，15.00 g/L酵母膏，9.00 g/L 酵母提取物，15.00 g/L胨化牛奶，1.20 g/L(NH4)2SO4，3.00 g/L NaCl，0.05 g/L FeSO4，1.00 g/L K2HPO4，pH值為7.2。種子培養(yǎng)基：10.0 g/L糊精，30.0 g/L酪蛋白胨，3.0 g/L酵母提取物，2.0 g/L MgSO4·7H2O，0.5 g/L KH2PO4，pH值為7.2。發(fā)酵培養(yǎng)基：60.00 g/L葡萄糖，20.00 g/L玉米漿干粉，5.00 g/L NaCl，5.00 g/L CaCO3，1.02 g/L MgSO4·7H2O，pH值為7.2。以上培養(yǎng)基均于 115 ℃ 滅菌25 min。

1.1.4 主要試劑與儀器 CH3OH、CH3CN均為色譜純，均購自德國Merck公司；碳源均為分析純，均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司；氮源均為分析純，均購自英國Oxoid公司。

Waters 515/2487型高效液相色譜儀，購自美國Waters公司；全自動(dòng)移液工作站epMotion 5070，購自德國Eppendorf公司；ISF12X恒溫恒濕搖床，購自瑞士Adolf Kuhner公司；HPS400生化培養(yǎng)箱，購自哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；離心機(jī)，購自德國Eppendorf公司；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，購自美國BD公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 制備孢子懸浮液 將出發(fā)菌株在產(chǎn)孢培養(yǎng)基上于 28～30 ℃ 培養(yǎng)6～8 d，用0.08%葡萄糖溶液沖洗斜面，用無菌竹簽將成熟孢子輕輕刮下，將孢子液移入含有玻璃珠的三角瓶中，振蕩。打散后的孢子液于孢子過濾器中進(jìn)行過濾，收集孢子懸浮液在28～30 ℃孵育8 h，孢子萌發(fā)后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，孢子懸浮液濃度約控制在108個(gè)/mL。

1.2.2 NTG誘變 取萌發(fā)好的孢子懸浮液分別分裝于含有2、3、4、5 mg/mL NTG溶液的Eppendorf管中，充分混勻，分別處理10、20、30、40、50、60 min后，于4 000 r/min離心10 min，收集菌體，用生理鹽水洗滌3次后，取100 μL孢子懸浮液進(jìn)行10倍梯度稀釋涂平板，每個(gè)梯度設(shè)3個(gè)重復(fù)；取未經(jīng)NTG誘變的孢子懸浮液進(jìn)行稀釋涂布，每個(gè)稀釋度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，作為對照組。將平板置于29 ℃培養(yǎng)6～8 d，形成單菌落。

1.2.3 生測初篩 向96孔板發(fā)酵液中加入2倍體積的甲醇浸提丁烯基多殺菌素，振蕩，4 000 r/min離心15 min，取 100 μL 上清液于新的96孔板中，避光條件下將有機(jī)溶劑揮發(fā)干凈，每孔加入100 μL去離子水復(fù)溶丁烯基多殺菌素，再向每孔加入5～8頭埃及伊蚊幼蟲，每隔1 h觀察記錄1次試驗(yàn)結(jié)果。每組試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)[17]。

1.2.4 培養(yǎng)條件 96孔板種子培養(yǎng)：接種量為15%，溫度為29 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為280 r/min，一級種子培養(yǎng)60 h，二級種子培養(yǎng)48 h。96孔板發(fā)酵培養(yǎng)：接種量為15%，溫度為29 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為280 r/min，培養(yǎng)8～10 d。種子搖瓶培養(yǎng)：300 mL三角瓶接種量為10%，溫度為29 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為240 r/min，培養(yǎng)48 h。發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)：300 mL三角瓶接種量為10%，溫度為29 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為240 r/min，培養(yǎng)7 d。

1.2.5 發(fā)酵液測定方法 丁烯基多殺菌素發(fā)酵產(chǎn)量的測定：取2 mL發(fā)酵液，加入4 mL甲醇浸提15 min，振蕩混勻，4 000 r/min 離心15 min，取1 mL上清液，12 000 r/min離心15 min，取上清液進(jìn)行高效液相色譜(high performance liquid chromatography，簡稱HPLC)分析。HPLC分析條件：Waters515型高效液相色譜儀，安捷倫XDB-C18反向色譜柱，流動(dòng)相中甲醇、乙腈、水的體積比為45 ∶45 ∶10(0.05%乙酸銨用水溶解后與有機(jī)試劑混合組成流動(dòng)相)，流速 1.0 mL/min，檢測波長為244 nm。根據(jù)積分面積，計(jì)算產(chǎn)量。

生物量測定：取8 mL發(fā)酵液，4 000 r/min離心15 min，計(jì)算固體沉淀占發(fā)酵液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2.6 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化 單一碳源：以葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇、糊精、甘油、可溶性淀粉等作為單一碳源，添加量均為60 g/L，基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中其他組分不變。復(fù)合碳源：60 g/L葡萄糖分別與10、20、30、40、50 g/L可溶性淀粉、糊精、甘露醇等搭配。速效氮源：玉米漿干粉、胨化牛奶、酵母膏、牛肉膏；遲效氮源：以棉籽蛋白、大豆餅粉、大豆蛋白胨、酪蛋白胨、酵母提取物、乳清蛋白等作為單一氮源，添加量均為20 g/L，其他組分不變。復(fù)合氮源：20 g/L玉米漿干粉分別與20 g/L棉籽蛋白、大豆餅粉、乳清蛋白等搭配。正交試驗(yàn)：將葡萄糖、糊精、玉米漿干粉、棉籽蛋白等進(jìn)行4因素4水平正交試驗(yàn)。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)采用Excel、Origin 8.0、SPSS 16.0 for Windows等軟件進(jìn)行分析。

致死率=[(誘變前總菌落數(shù)-誘變處理后的總菌落數(shù))/誘變前總菌落數(shù)]×100%；突變率=正突變率+負(fù)突變率。

2 結(jié)果與分析

2.1 NTG誘變對須糖多孢菌的作用

2.1.1 NTG對ASAGF58菌株的誘變效應(yīng) 由圖1可知，不同濃度的NTG對ASAGF58菌株的致死率均隨著誘變時(shí)間的延長而增大，其中高濃度的NTG誘變效果明顯強(qiáng)于低濃度。據(jù)報(bào)道，致死率為80.0%～90.0%時(shí)，正突變菌株較多，致死率為90.0%～99.9%時(shí)，負(fù)突變菌株較多[14]。NTG濃度為2、3 mg/mL時(shí)，最大致死率不足50%，因此不進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對ASAGF58菌株的正負(fù)突變率進(jìn)行分析，由圖1、圖2可知，當(dāng)NTG濃度為4 mg/mL時(shí)，誘變50 min時(shí)致死率為85%，此時(shí)正突變率最大，為29%；當(dāng)NTG濃度為5 mg/mL時(shí)，誘變30 min時(shí)致死率為88%，此時(shí)正突變率最大，為25%，這與何新舟等的研究結(jié)果[14]一致。挑取1 500株單菌落經(jīng)初篩、復(fù)篩后，得到28株丁烯基多殺菌素產(chǎn)量提高20%以上的突變菌株，7株產(chǎn)量提高30%以上的突變菌株。其中，7株高產(chǎn)菌株對應(yīng)不同的NTG濃度和時(shí)間，說明NTG誘變對丁烯基多殺菌素產(chǎn)量的影響是隨機(jī)的。

2.1.2 高產(chǎn)菌株遺傳穩(wěn)定性驗(yàn)證 由于突變菌株自身攜帶修復(fù)機(jī)制以及遺傳不穩(wěn)定性等特點(diǎn)，在進(jìn)行菌種轉(zhuǎn)接過程中可能會出現(xiàn)表型延遲現(xiàn)象，導(dǎo)致突變株發(fā)酵產(chǎn)量下降[18]。因此，須要對篩選出的7株高產(chǎn)突變菌株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性驗(yàn)證。由圖3可知，2-G4突變株轉(zhuǎn)接3、4次后丁烯基多殺菌素發(fā)酵產(chǎn)量與轉(zhuǎn)接2次相比，分別提高3.2%、1.08%；與轉(zhuǎn)接2次相比，9-H11突變株在轉(zhuǎn)接3次時(shí)產(chǎn)量下降5.3%，轉(zhuǎn)接4次時(shí)產(chǎn)量提高 10.53%，產(chǎn)量變化幅度超過10%，表明9-H11菌株的遺傳穩(wěn)定性較差；此外，其余5個(gè)菌株與2-G4菌株相比相對產(chǎn)量較低。ASAGF58菌株經(jīng)NTG誘變后篩選出1株發(fā)酵產(chǎn)量較高，且遺傳穩(wěn)定的突變菌株2-G4(5 mg/mL NTG誘變50 min)，與出發(fā)菌株相比，其丁烯基多殺菌素產(chǎn)量提高86.7%。

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

2.2.1 碳源篩選 碳源、氮源是培養(yǎng)基的重要組成部分，同時(shí)嚴(yán)重影響菌絲體生長及微生物次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。以高產(chǎn)菌株2-G4作為出發(fā)菌株，前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，除葡萄糖、甘露醇外，突變菌株2-G4在其余幾種單一碳源培養(yǎng)基中丁烯基多殺菌素的產(chǎn)量均為0，而以葡萄糖作為單一碳源時(shí)，丁烯基多殺菌素發(fā)酵產(chǎn)量和生物量都優(yōu)于甘露醇。因此，選擇葡萄糖作為碳源進(jìn)行下一步的優(yōu)化試驗(yàn)。由表1可知，培養(yǎng)7 d后菌體的生物量均有所增加，尤其當(dāng)葡萄糖與 30 g/L 糊精搭配時(shí)生物量達(dá)到最大值，為 6.53%；同時(shí)，大部分復(fù)合碳源發(fā)酵后均有利于丁烯基多殺菌素產(chǎn)生，其中當(dāng)糊精加入量為50 g/L時(shí)，相對產(chǎn)量達(dá)到最大值，為111.6%，其次是糊精加入量為40 g/L時(shí)?？赡苁瞧咸烟亲鳛樗傩荚?，前期容易被菌體很好地吸收利用，而作為遲效碳源的糊精在發(fā)酵過程中緩慢分解成葡萄糖被利用。因此，選擇60 g/L葡萄糖和50 g/L糊精進(jìn)行下一步培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2.2 氮源篩選 由表2可知，大多數(shù)單一有機(jī)氮源的添加均有利于2-G4突變菌株產(chǎn)丁烯基多殺菌素，特別是含有玉米漿干粉的培養(yǎng)基，突變菌株經(jīng)發(fā)酵后丁烯基多殺菌素的相對產(chǎn)量最高，為110%，胨化牛奶作為氮源時(shí)次之。從菌體生長情況來看，以胨化牛奶作為單一氮源時(shí)所獲得的菌體生物量最高，為6.4%，玉米漿干粉次之?？紤]到培養(yǎng)基成本等因素，發(fā)酵培養(yǎng)基中添加20 g/L玉米漿干粉對丁烯基多殺菌素的生成有明顯的促進(jìn)作用。

由圖4可知，玉米漿干粉與棉籽蛋白、大豆餅粉搭配時(shí)，丁烯基多殺菌素的相對產(chǎn)量明顯高于它與乳清蛋白、胨化牛奶搭配時(shí)的產(chǎn)量?？赡芤?yàn)橛衩诐{干粉與棉籽蛋白、大豆餅粉搭配作氮源時(shí)，其氨基酸的種類及含量更適合丁烯基多殺菌素的產(chǎn)生。2-G4突變菌株在含棉籽蛋白的培養(yǎng)基中丁烯基多殺菌素的相對產(chǎn)量比含大豆餅粉的高8%，因此，選擇玉米漿干粉和棉籽蛋白作為復(fù)合氮源。

表1 不同碳源對菌體生長和丁烯基多殺菌素合成的影響

注：G代表60 g/L葡萄糖；S代表可溶性淀粉；D代表糊精；M代表甘露醇；字母下標(biāo)數(shù)字代表相應(yīng)的碳源含量，單位為g/L。以2-G4菌株在以葡萄糖作為單一碳源時(shí)丁烯基多殺菌素的產(chǎn)量作為100%。

表2 單一有機(jī)氮源對菌體生長和丁烯基多殺菌素合成的影響

注：以2-G4菌株在60 g/L葡萄糖、50 g/L糊精為碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中丁烯基多殺菌素的產(chǎn)量作為100%。

2.2.3 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)4因素4水平的正交試驗(yàn)。由表3可知，各因素對丁烯基多殺菌素生成的影響表現(xiàn)為C(玉米漿干粉用量)>A(葡萄糖用量)>B(糊精用量)>D(棉籽蛋白用量)。通過方差分析可知，突變菌株2-G4產(chǎn)丁烯基多殺菌素的發(fā)酵培養(yǎng)基最佳碳源、氮源組合為A3B2C1D4，即100 g/L葡萄糖、50 g/L糊精、20 g/L玉米漿干粉、80 g/L棉籽蛋白。驗(yàn)證試驗(yàn)表明，突變菌株在該培養(yǎng)基中丁烯基多殺菌素的產(chǎn)量比優(yōu)化前提高52.1%。

3 討論

以ASAGF58作為出發(fā)菌株進(jìn)行不同NTG濃度(2、3、4、5 mg/mL)和不同作用時(shí)間(10、20、30、40、50、60 min)的誘變，通過96孔板發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)合生物檢測進(jìn)行初篩、搖瓶復(fù)篩后，丁烯基多殺菌素產(chǎn)量提高30%以上的突變株有7株，經(jīng)遺傳穩(wěn)定性驗(yàn)證后最終獲得1株高產(chǎn)菌株2-G4(5 mg/mL NTG誘變50 min)，與出發(fā)菌株相比，其丁烯基多殺菌素產(chǎn)量提高86.7%。其中，5 mg/mL NTG比其他濃度的致死率高，負(fù)突變率也相對較高，而正突變率偏低，但篩選出的高產(chǎn)菌株大多數(shù)來自該濃度，表明誘變效果與致死率、突變率無明顯相關(guān)性。說明NTG對丁烯基多殺菌素產(chǎn)量的影響是隨機(jī)的。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

注：以2-G4菌在優(yōu)化后的培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)量為100%。

以突變菌株2-G4為出發(fā)菌株，進(jìn)行碳源、氮源單因素優(yōu)化試驗(yàn)，結(jié)果顯示，當(dāng)培養(yǎng)基中加入葡萄糖、糊精、玉米漿干粉、棉籽蛋白時(shí)均能有效促進(jìn)突變菌株的生長和丁烯基多殺菌素產(chǎn)量的提高。其中，葡萄糖作為速效碳源能被迅速分解利用參與生長代謝，糊精作為遲效碳源易被菌體水解為單糖后再利用，用于維持菌體代謝和產(chǎn)物合成；玉米漿干粉含有較為豐富的蛋白質(zhì)和生長因子，作為速效氮源能有效促進(jìn)菌體生長，而棉籽蛋白的添加更有利于生產(chǎn)丁烯基多殺菌素。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行4因素4水平正交試驗(yàn)，得到優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為100.00 g/L葡萄糖、50.00 g/L糊精、20.00 g/L玉米漿干粉、80.00 g/L棉籽蛋白、5.00 g/L NaCl、5.00 g/L CaCO3、1.02 g/L MgSO4·7H2O，pH值為7.2。突變菌株2-G4在優(yōu)化后的培養(yǎng)基中丁烯基多殺菌素的產(chǎn)量比優(yōu)化前提高52.1%。

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