楊 威， 閆海霞， 張貝貝， 張溫馨， 郭堅(jiān)華， 羅玉明

(1.淮陰師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院/江蘇省環(huán)洪澤湖生態(tài)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇淮安 223300；2.江蘇省淮安市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，江蘇淮安 223300； 3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，江蘇南京 210095)

淮安紅椒產(chǎn)自我國地理南北分界線特定的江蘇省淮安市轄區(qū)內(nèi)，已有近30年的發(fā)展歷史，先后榮獲“國家地理標(biāo)志證明商標(biāo)”“江蘇省名牌農(nóng)產(chǎn)品”等殊榮。近年來，淮安紅椒生產(chǎn)呈現(xiàn)出快速發(fā)展的態(tài)勢，截至2010年，淮安市大棚紅椒種植面積達(dá)1.4萬hm2，占全市設(shè)施蔬菜面積的36.2%。全市年產(chǎn)紅椒45萬t以上，年銷售收入超過23億元[1-2]。在快速發(fā)展的同時，淮安紅椒在種植過程中也存在一系列問題。如規(guī)模經(jīng)營比例較小、無公害標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)技術(shù)難以推廣以及濫用農(nóng)藥現(xiàn)象較多，產(chǎn)品質(zhì)量存在安全隱患。其中，特別是在病蟲害的防治過程中，化學(xué)農(nóng)藥的大量使用，對食品安全，品牌效應(yīng)的提升等產(chǎn)生了嚴(yán)重的阻礙。其中，在淮安紅椒的生產(chǎn)過程中，尤以疫病的發(fā)生最為嚴(yán)重。辣椒疫病是由辣椒疫霉(PhytophthoracapsiciLeon)引起的一種毀滅性病害，一般田間發(fā)病率為5%～65%，平均發(fā)病率達(dá)24.4%，發(fā)病嚴(yán)重的可減產(chǎn)40%～70%，甚至絕收[3]。對辣椒疫病的防治方法主要包括種植抗病品種、農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治、生物防治?？共∑贩N使用較少，最常使用的防治方法是化學(xué)防治，主要藥劑包括甲霜靈、代森錳鋅、甲霜·錳鋅、氧化亞銅可濕性粉劑等(http：//www.chinapesticide.gov.cn)。

對于辣椒疫病的生物防治在國內(nèi)外均有較多的研究。Segarra等比較了生防制劑棘孢木霉T34和土菌靈在辣椒疫病防治中的效果，發(fā)現(xiàn)T34菌株的防治效果達(dá)71%，而土菌靈只有在與病原菌同時接種時才能起到防治作用[4]。Sopheareth等在2013年報(bào)道，伯克霍爾德式菌(Burkholderiacepacia)MPC-7制劑能夠顯著防治辣椒疫病，平均防效達(dá)60%，同時該生防菌能夠顯著促進(jìn)植物的生長及生物量的增加[5]。劉永亮等通過平板對峙法篩選得到1株金色毛殼菌HTC，對辣椒疫病的防治效果高于70%[6]。歐雄常等應(yīng)用紅樹內(nèi)生細(xì)菌解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)RS261菌株在辣椒植株根部定殖防治辣椒疫病，6 d時的防治效果高于80%，并增強(qiáng)了植株的防御酶活性[7-8]。人們還發(fā)現(xiàn)，生防菌能夠產(chǎn)生生物膜來阻擋辣椒疫霉的侵染。如約氏黃桿菌GSE09能夠在植物體表面產(chǎn)生生物膜，同時產(chǎn)生一些吲哚類化合物、酵母促生物、表面活性劑等物質(zhì)來防治辣椒疫霉[9]。這些生防菌生物膜和代謝產(chǎn)物在辣椒根圍形成了一定的屏障，改變了根圍微生態(tài)環(huán)境，但根圍微生態(tài)改變的意義尚未引起足夠的重視。

微生物菌肥“寧盾”是由筆者所在項(xiàng)目組前期與南京農(nóng)業(yè)大學(xué)聯(lián)合開發(fā)研制，于2013年取得生物肥料正式登記證[微生物肥(2013)準(zhǔn)字(1096)號]。在前期工作中，“寧盾”在防治辣椒土傳病害中取得了較好的效果[10-11]，在研究中發(fā)現(xiàn)“寧盾”的使用對田間病害的防治效果可以持續(xù)到下一茬作物，下一茬種植過程中即便不再施藥，辣椒仍然生長良好，病害發(fā)生較輕。因此，本試驗(yàn)旨在檢測“寧盾”在防治辣椒土傳病害過程中，對辣椒根圍細(xì)菌多樣性及主要土壤酶活性和土壤養(yǎng)分的影響，以期為該微生物菌肥的進(jìn)一步應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及土壤樣品采集

本研究地點(diǎn)設(shè)在江蘇省淮安市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心蔬菜園區(qū)，在辣椒移栽時利用微生物菌劑“寧盾”進(jìn)行灌根處理，并分別在移栽1、2、3個月后采集辣椒根圍土壤進(jìn)行檢測。以未使用微生物菌劑的辣椒作為對照組，處理組和對照組試驗(yàn)小區(qū)隨機(jī)分布，每個處理3次重復(fù)，每個小區(qū)面積為3 m×2 m。處理組包含4個辣椒品種，分別為紅優(yōu)4號(TH)、馬六(TM)、好農(nóng)50(TA)、蘇椒5號(TS)，對照組為紅優(yōu)4號(CH)。

整個土壤采集過程采用3點(diǎn)取樣法，每個小區(qū)選取3株間距1 m的辣椒植株，首先將植株拔出，輕輕抖動以去除黏附在根部的大量土壤，再利用毛刷輕輕刷下緊貼在辣椒根部的土壤，3株辣椒土壤樣品混合在一起，裝入塑封袋放在冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室。樣品前期處理后研磨過2 mm篩，一部分進(jìn)行土壤總DNA的提取、變性梯度凝膠電泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，簡稱PCR-DGGE)分析；另一部分置于陰涼通風(fēng)處自然干燥至恒質(zhì)量，用作土壤理化性質(zhì)及酶活性檢測；剩余的則置于 -20 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 土壤樣品DNA提取及DGGE分析

本研究利用FastDNA SPIN Kit for Soil試劑盒(MP Bio，USA)進(jìn)行土壤樣品總DNA的提取，提取方法參照試劑盒試驗(yàn)說明。以樣品基因組DNA為模板，采用細(xì)菌通用引物 GC-338F 和518R擴(kuò)增樣品16S rDNA高變區(qū)序列，引物信息如表1 所示。

表1 土壤樣品16S rDNA擴(kuò)增引物信息

PCR擴(kuò)增體系(50 μL)：10× PCR buffer 5 μL、dNTP(2.5 mmol/L)3.2 μL、rTaq(5 U/μL)0.4 μL、GC-338F(20 μmol/L)1 μL、518R(20 μmol/L)1 μL、模板DNA 50 ng、補(bǔ)充ddH2O至50 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性 1 min，55 ℃復(fù)性45 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；最終 72 ℃ 延伸10 min。PCR產(chǎn)物采用OMEGA公司DNA Gel Extraction Kit試劑盒純化回收。DGGE梯度膠根據(jù)Heuer等的方法[12]制備。DGGE在DCode突變檢測系統(tǒng)(Bio-Rad)中完成。用25 μL PCR濃縮產(chǎn)物進(jìn)行DGGE，采用變性梯度為30%～60%、濃度為8%的丙烯酰胺凝膠[100%濃度定義為 7 mol/L 尿素和40%的去離子甲酰胺]在1×TAE電泳緩沖液中、130 V電壓、60 ℃下電泳7 h。電泳后用銀染10～15 min，掃描并拍照。比對不同處理組和對照組之間差異性條帶，切膠回收、測序比對。測序結(jié)果采用DNAstar和Cluster軟件進(jìn)行序列分析，下載最相似的菌株序列作為系統(tǒng)發(fā)育樹的參考序列。然后采用MEGA軟件、Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展數(shù)為1 000。主成分分析在CANOCO 4.5軟件中進(jìn)行。

細(xì)菌多樣性指數(shù)是研究群落物種數(shù)和個體數(shù)以及均勻度的綜合指標(biāo)。根據(jù)電泳圖譜中樣品條帶數(shù)目及每個條帶的強(qiáng)度(灰度)，對各樣品中細(xì)菌香農(nóng)指數(shù)、均勻度、豐富度等指標(biāo)進(jìn)行分析。DGGE圖譜采用Quantity one軟件對每個樣品的電泳條帶數(shù)目、條帶密度進(jìn)行數(shù)字化分析。

1.3 土壤酶活性及理化性質(zhì)測定

土壤酶活性測定包括脲酶、磷酸酶、蔗糖酶、過氧化氫酶等的測定，具體操作參考關(guān)松蔭的方法[13]。土壤理化性質(zhì)測定包括速效氮、速效磷、速效鉀、有機(jī)質(zhì)等含量的測定，具體操作參考魯如坤的方法[14]。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel處理后作圖，用SPSS 16.0對各處理之間的差異性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒根圍細(xì)菌DGGE指紋圖譜分析

由表2可知，微生物菌肥“寧盾”處理組相對于對照組，辣椒根圍微生物多樣性呈現(xiàn)下降趨勢，從香農(nóng)指數(shù)、豐富度的結(jié)果來看，處理組除了TM組在第2個采樣時間點(diǎn)高于對照組以外，其他所有處理組在3個采樣時間點(diǎn)均低于對照組。說明在施用微生物菌肥后能夠降低辣椒根圍土壤微生物的多樣性，使其中個別微生物成為優(yōu)勢種群。另外，由于本次試驗(yàn)采用的是基質(zhì)栽培，因此，辣椒根圍微生物多樣性總體偏低。

表2 基于DGGE圖譜的土壤樣品微生物多樣性分析

2.2 DGGE圖譜的主成分分析

為了使DGGE結(jié)果顯現(xiàn)更加直觀，本試驗(yàn)中將DGGE圖譜進(jìn)行量化，根據(jù)其灰度進(jìn)行主成分分析。由圖1可知，在施用微生物菌劑后短時間內(nèi)，處理組4個品種和對照組辣椒根圍土壤微生物多樣性差異不明顯，但隨著種植時間的延長，處理組中TM、TA組與對照組之間逐漸開始顯現(xiàn)差異性，而TH、TS組無明顯變化，說明微生物菌劑的應(yīng)用能夠改變辣椒根圍微生物的組成與密度。

2.3 DGGE測序條帶的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

為明確施用微生物菌劑對辣椒根圍微生物種類的影響，對DGGE指紋圖譜中差異條帶進(jìn)行切膠測序比對。由圖2可知，在處理組和對照組中有些微生物類群始終處于優(yōu)勢種群地位，如球形桿菌屬(band6，Sphaerobactersp.)、Dyella屬(band7，Dyellasp.)、鏈霉菌屬(band32，Streptomycessp.)等。另外，使用微生物菌劑后辣椒根圍新出現(xiàn)的微生物類群主要包括類香味菌屬(band12，Myroidessp.)、芽孢桿菌屬(band 36，Bacillussp.)、嗜冷芽孢桿菌屬(band27，Psychrobacillussp.)、赤細(xì)菌屬(band28，Erythrobactersp.)等，其中出現(xiàn)最多的為芽孢桿菌屬，芽孢桿菌為微生物菌肥“寧盾”的主要成分。

2.4 土壤酶活性測定結(jié)果

由圖3可知，微生物菌肥處理后，在3個采樣時間點(diǎn)，處理組的土壤酶活性相對對照組普遍升高。不同辣椒品種之間土壤酶活性變化差異不大。作為同一品種，紅優(yōu)4號經(jīng)過微生物菌肥處理后在3個采樣時間點(diǎn)除蔗糖酶外所有土壤酶活性均明顯高于對照組，其中脲酶活性分別提高20%、12%、21%，磷酸酶活性分別提高29%、31%、33%，纖維素酶活性分別提高100%、180%、265%，過氧化氫酶活性分別提高40%、66%、16%。說明微生物菌肥使用后能夠在一定時期內(nèi)提高辣椒根圍土壤酶活性。

2.5 土壤主要營養(yǎng)指標(biāo)測定結(jié)果

由圖4可知，微生物菌肥處理組和對照組在3個采樣時間點(diǎn)根圍土壤中氮、磷、鉀及有機(jī)質(zhì)含量變化趨勢基本一致，均呈先降后升的趨勢。但微生物菌肥處理組在3個時間點(diǎn)的主要營養(yǎng)指標(biāo)含量均高于對照組。不同辣椒品種之間，在微生物菌肥處理后3個時間點(diǎn)氮、磷、鉀及有機(jī)質(zhì)含量差異不大。在同一品種紅優(yōu)4號中，微生物菌肥處理組與對照組相比水解性氮含量分別提高8%、29%、37%，速效磷含量分別提高21%、48%、0，速效鉀含量分別提高19%、26%、36%，有機(jī)質(zhì)含量分別提高11%、23%、43%。除了處理3個月后時的速效磷含量之外，其他營養(yǎng)指標(biāo)在3個時間點(diǎn)的提高幅度均呈現(xiàn)上升趨勢。說明在微生物菌肥處理后，能夠在更長時間內(nèi)為寄主植物提供充足營養(yǎng)。

3 討論與結(jié)論

微生物菌肥由于含有能夠協(xié)助寄主植物抗病促生的活性有益菌，在施用后能夠在植物根圍有效定殖，且在較長時期內(nèi)通過提高土壤酶活性、加速土壤中養(yǎng)分循環(huán)、抑制病害發(fā)生等方面發(fā)揮有益作用[15-16]。但對于微生物菌肥的使用方式、對不同土壤條件的適應(yīng)性以及在不同品種寄主植物上的作用差異等還須要更深入地研究。

本研究通過PCR-DGGE分析方法研究了微生物菌肥“寧盾”在不同辣椒品種上使用后對于寄主根圍細(xì)菌多樣性的變化，并測定了相關(guān)土壤酶活性以及土壤主要養(yǎng)分含量的變化情況。發(fā)現(xiàn)在“寧盾”使用以后，其中主要成分芽孢桿菌能夠在寄主根圍土壤中穩(wěn)定定殖，且隨著生長期的延長，處理組與對照組在根圍細(xì)菌多樣性上開始逐漸呈現(xiàn)差異化。同時，與根圍微生物活性相關(guān)的幾種土壤酶活性在處理組中均高于對照組，包括脲酶、過氧化氫酶、蔗糖酶，纖維素酶、磷酸酶等。另外，從辣椒根圍土壤中主要養(yǎng)分指標(biāo)測定結(jié)果來看，處理組均明顯高于對照組，且隨著辣椒生長期的延長，主要營養(yǎng)指標(biāo)在3個時間點(diǎn)的提高幅度基本呈上升趨勢。說明在微生物菌肥處理后，能夠在更長時間內(nèi)為寄主植物提供充足營養(yǎng)。從辣椒品種來看，微生物菌肥使用后在不同辣椒品種之間的影響差異不明顯。

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