張 穎， 王俊芳

(河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南開封 475004)

由立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)引起的芝麻立枯病是一種嚴重的土傳病害，廣泛分布于各芝麻種植區(qū)[1]。目前，由于缺乏抗病芝麻品種，生產(chǎn)上主要通過施用化學(xué)殺菌劑控制該病害，導(dǎo)致藥劑殘留、病原菌產(chǎn)生抗藥性、環(huán)境污染、芝麻種植成本提高與品質(zhì)下降等狀況發(fā)生[2]，采用環(huán)保的生物防治技術(shù)替代傳統(tǒng)的化學(xué)方法防治芝麻病害是目前芝麻種植中亟待解決的問題。

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)是一類廣泛分布于自然環(huán)境中的革蘭氏陽性細菌，大多數(shù)對植株、人、畜無害，且不污染環(huán)境，這類細菌因其能產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì)，且能形成耐熱、耐酸堿和抗逆性強的芽孢，從而作為植物病害生防菌得到廣泛的研究和應(yīng)用[3-5]。在筆者前期研究工作中，從健康芝麻苗根部分離到1株對芝麻立枯病有顯著防治效果的內(nèi)生細菌，該菌株編號為G10，經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌[6]。為明確G10菌株在植物病害生物防治中的應(yīng)用潛力，本研究分別測定pH值、溫度、鹽離子、紫外線等對其代謝產(chǎn)物抑菌效果的影響，以期為該菌生防制劑的研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料及培養(yǎng)基

枯草芽孢桿菌G10菌株、立枯絲核菌菌株均由河南大學(xué)微生物實驗室提供；G10菌株培養(yǎng)采用KBM培養(yǎng)基(2.00%蛋白胨、1.00%甘油、0.15% K2HPO4、0.15% MgSO4·7H2O、2.00%瓊脂，121 ℃滅菌20 min)[7]；立枯絲核菌培養(yǎng)采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基(200 g馬鈴薯、20 g葡萄糖、20 g瓊脂、1 000 mL自來水)[8]；生物膜測定使用LB培養(yǎng)基(1.0%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1.0% NaCl、2.0%瓊脂)和Landy培養(yǎng)基(2.00%葡萄糖、0.50%谷氨酸、0.50 g MgSO4、0.50 g KCl、1.00 g KH2PO4、0.15 mg Fe2SO4·6H2O、5.00 mg MnSO4·H2O、10.16 mg CuSO4·5 H2O，1 000 mL蒸餾水)。

1.2 試驗方法

1.2.1 G10菌株代謝產(chǎn)物對立枯絲核菌生長半抑制有效濃度(EC50)的估算 將活化后的G10菌株培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于KBM液體培養(yǎng)基中，每瓶培養(yǎng)基裝液量為30 mL，于30 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)48 h；將培養(yǎng)液離心，收集上清液，過濾，將無菌發(fā)酵液與溫度不低于45 ℃的固體PDA培養(yǎng)基混合，分別配制成發(fā)酵液濃度為2%、5%、10%、20%、30%、40%等的培養(yǎng)基。將配制好的培養(yǎng)基倒平板，將活化后的立枯絲核菌打成6 mm菌餅，轉(zhuǎn)接于平板中央；以不添加發(fā)酵液的PDA培養(yǎng)基為對照，30 ℃培養(yǎng)24 h，統(tǒng)計G10菌株代謝產(chǎn)物對立枯絲核菌的抑制率，公式如下：

抑菌率=[(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑]×100%。

1.2.2 G10菌株代謝產(chǎn)物濃縮液的制備及不同pH值對其抑制立枯絲核菌的影響 G10菌株無菌發(fā)酵液制備方法同“1.2.1”節(jié)，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將無菌上清液濃縮50%，將培養(yǎng)48 h后的生防菌代謝產(chǎn)物濃縮液分裝入不同的管中，分別用乳酸和NaOH溶液調(diào)節(jié)濃縮液的pH值，使其pH值分別為1、2、3、4、5、10、11、12、13，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將活化的立枯絲核菌平板培養(yǎng)物打成菌餅，將菌餅置于PDA平板中央，在距離平板中央2 cm處對稱放置4個牛津杯，分別取150 μL以上不同pH值的濃縮液，注入杯中；設(shè)只接立枯絲核菌的平板為空白對照1，相應(yīng)pH值的無菌KBM液體培養(yǎng)基為空白對照2。30 ℃培養(yǎng)24 h，統(tǒng)計G10菌株代謝產(chǎn)物對立枯絲核菌的抑制率。對照2的抑菌率=[(對照1菌落直徑-對照2菌落直徑)/對照1菌落直徑]×100%；生防菌發(fā)酵液抑菌率=[(對照2菌落直徑-處理菌落直徑)/對照2菌落直徑]×100%。

1.2.3 不同溫度處理后G10菌株代謝產(chǎn)物對立枯絲核菌的抑制作用 將“1.2.2”節(jié)中代謝產(chǎn)物濃縮液分裝入不同的管中，將各管分別放入溫度為-20、40、50、60、70、80、90、100 ℃的水浴鍋中處理20 min；測定處理后的代謝產(chǎn)物對立枯絲核菌的抑制作用，方法同“1.2.2”節(jié)。以濃縮液不處理的板為對照，計算抑菌率，方法同“1.2.1”節(jié)。

1.2.4 不同鹽離子條件下G10菌株代謝產(chǎn)物的抑菌作用 分別配制1 mol/L的CaCl2、NaCl、KCl、MgSO4、AlCl3、CuSO4溶液，將“1.2.2”節(jié)中代謝產(chǎn)物濃縮液分裝入不同的管中，分別加入適量上述各鹽溶液，使各管中的鹽離子濃度為 20 mmol/L。測定處理后代謝產(chǎn)物的抑菌作用，方法同“1.2.2”節(jié)。以濃縮液不處理的板為對照，計算抑菌率，方法同“1.2.1”節(jié)。

1.2.5 不同紫外線劑量條件下G10菌株代謝產(chǎn)物對立枯絲核菌的抑制作用 將“1.2.2”節(jié)中濃縮液以5 mL/皿裝入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，3次重復(fù)，在20 W紫外燈下分別照射5、10、15、20、25、30 min，測定濃縮液的抑菌作用，方法同“1.2.2”節(jié)。以濃縮液不處理的板為對照，計算抑菌率，方法同“1.2.2”節(jié)。

1.2.6 G10菌株生物膜形成能力的測定

1.2.6.1 定性測定生物膜形成 將活化后的生防菌轉(zhuǎn)接于裝有30 mL KBM液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在30 ℃、200 r/min搖床上振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)至對數(shù)期。將對數(shù)期的生防菌菌懸液以10%的接種量分別轉(zhuǎn)接于含有2 mL LB培養(yǎng)基和Landy培養(yǎng)基的5 mL玻璃試管中(直徑為0.8 cm)，23 ℃靜置培養(yǎng)6 d，觀察菌體在試管內(nèi)的生長情況，定性測定生物膜的形成情況[9]。

1.2.6.2 結(jié)晶紫顯色法測定生物膜的形成 取“1.2.6.1”節(jié)中長有生物膜的試管，小心吸出2 mL管中培養(yǎng)液，注意保持管壁生物膜的完好。滴加3 mL濃度為0.1%的結(jié)晶紫溶液，常溫染色20 min。然后去除染液，加蒸餾水脫色3次。向管中加入2.5 mL乙醇、丙酮混合溶解液(乙醇、丙酮的體積比為8 ∶2)，待生物膜溶解后，以溶解液作為對照，利用分光光度計測定570 nm處的吸光度(D570 nm)。重復(fù)10次。

1.3 數(shù)據(jù)分析

對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析、顯著性檢驗和新復(fù)極差法多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防菌代謝產(chǎn)物對立枯絲核菌的抑制作用

利用平板培養(yǎng)法檢測不同濃度條件下G10菌株代謝產(chǎn)物對立枯絲核菌的抑制作用。由表1可知，隨著代謝產(chǎn)物濃度的升高，抑菌率逐漸提高，不同濃度代謝產(chǎn)物的抑菌率差異顯著(P<0.05)。

表1 不同濃度G10菌株代謝產(chǎn)物對立枯絲核菌的抑制作用

注：數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

利用表1中數(shù)據(jù)進行線性回歸分析，估算代謝產(chǎn)物的半抑制有效濃度，以抑制率作為橫坐標X，并對抑菌率進行概率坐標轉(zhuǎn)換，查表得轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)(X′)，以代謝產(chǎn)物濃度作為縱坐標Y，并對代謝產(chǎn)物濃度進行對數(shù)轉(zhuǎn)換(Y′)。由圖1可知，通過線性回歸分析得回歸方程Y′=0.646 0X′+1.103 3，r2=0.990 8。EC50處的抑制率為50%，相應(yīng)的X′=0，Y′=12.68，在這種處理條件下，G10代謝產(chǎn)物對立枯絲核菌的半抑制有效濃度為12.68%。

2.2 不同pH值條件下G10菌株代謝產(chǎn)物的抑菌作用

利用平板對峙培養(yǎng)法檢測不同pH值條件下濃縮50%的G10菌株代謝產(chǎn)物及相應(yīng)pH值條件下KBM培養(yǎng)基對立枯絲核菌的抑制作用。由圖2可知，該菌代謝產(chǎn)物在pH值為 6～9 范圍內(nèi)穩(wěn)定，發(fā)揮正常的抑菌作用；在pH值≤5及pH值≥10的條件下，其代謝產(chǎn)物的抑菌率逐漸下降。pH值為 6～9 時與pH值為10～13、1～4時的抑菌率，pH值為10～11、3～5時與pH值為12～13、1～2時的抑菌率差異達顯著水平(P<0.05)。pH值為12時與pH值為13時的抑菌率差異顯著(P<0.05)。

由圖3可知，在pH值為4～10范圍內(nèi)立枯絲核菌可以正常生長；在pH值≤3及pH值≥11時，KBM培養(yǎng)基抑制立枯絲核菌的生長。

2.3 溫度對G10菌株代謝產(chǎn)物抑菌作用的影響

經(jīng)不同溫度處理G10菌株代謝產(chǎn)物濃縮物，用對峙培養(yǎng)法測定其代謝產(chǎn)物對立枯絲核菌的抑制作用。由圖4可知，經(jīng)40、50 ℃處理，G10菌株代謝產(chǎn)物的抑菌率與對照無顯著差異，其他溫度處理的G10菌株代謝產(chǎn)物的抑菌率與對照均差異顯著(P<0.05)； 80 ℃與90、100 ℃ 處理的G10菌株代謝產(chǎn)物的抑菌率差異顯著。

2.4 不同鹽離子對G10菌株代謝產(chǎn)物抑菌作用的影響

采用對峙培養(yǎng)法檢測生防菌代謝產(chǎn)物在不同鹽離子條件下對立枯絲核菌的抑制能力。由圖5可知，對照與添加鹽離子處理的發(fā)酵液的抑菌率差異極顯著(P<0.01)；添加NaCl、KCl、CaCl2、AlCl3與添加MgSO4、CuSO4的發(fā)酵液的抑菌率差異顯著(P<0.05)；添加NaCl、KCl、CaCl2、AlCl3的發(fā)酵液之間的抑菌率差異不顯著，添加MgSO4、CuSO4的發(fā)酵液的抑菌率差異不顯著。

2.5 紫外線對G10菌株代謝產(chǎn)物抑菌作用的影響

生防菌代謝產(chǎn)物經(jīng)不同時間的紫外線照射后，用牛津杯法測定G10菌株代謝產(chǎn)物對立枯絲核菌的抑制作用。由圖6可知，對照與紫外線處理5、10 min與其他處理的發(fā)酵液抑菌率差異極顯著(P<0.01)；紫外線處理15、20、25 min與處理30 min的抑菌率差異極顯著(P<0.01)。對照與紫外線處理5、10 min之間的抑菌率差異不顯著； 紫外線處理15、20 min與處理25 min的抑菌率差異不顯著。

2.6 G10菌株生物膜形成能力測定

測定內(nèi)生菌形成生物膜的能力，將G10菌株分別接入LB和Landy液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。由圖7可知，2管均形成生物膜，左管為LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，右管為Landy培養(yǎng)基培養(yǎng)，其中Landy培養(yǎng)基內(nèi)的生物膜相對較厚。利用結(jié)晶紫顯色法測定G10菌株形成生物膜的能力，結(jié)果顯示利用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)時，該菌株形成的生物膜D570 nm平均值為1.125，利用Landy培養(yǎng)基培養(yǎng)時，D570 nm平均值為1.632。說明菌體在普通培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)即可形成明顯的生物膜，但不同營養(yǎng)條件下菌體產(chǎn)生生物膜的能力不同。

3 討論與結(jié)論

利用平板培養(yǎng)法檢測不同濃度條件下G10菌株代謝產(chǎn)物對立枯絲核菌的抑制作用，結(jié)果顯示，隨著G10菌株發(fā)酵液濃度的提高，抑菌率逐漸提高，不同濃度發(fā)酵液抑菌率差異顯著(P<0.05)；對試驗數(shù)據(jù)進行線性回歸分析，估算出G10代謝產(chǎn)物對立枯絲核菌的EC50為12.68%；G10菌株代謝產(chǎn)物在pH值為6～9范圍內(nèi)穩(wěn)定，發(fā)揮正常的抑菌作用；在pH值 ≤5及pH值≥10時， 其代謝產(chǎn)物的抑菌率逐漸下降。該

菌代謝產(chǎn)物在40～50 ℃溫度范圍內(nèi)抑菌率差異不顯著，高于60 ℃時代謝產(chǎn)物抑菌率顯著下降(P<0.05)；研究顯示幾種鹽離子對代謝產(chǎn)物的抑菌率均有一定的負作用；紫外線照射處理10 min內(nèi)該菌代謝產(chǎn)物抑菌性能穩(wěn)定，紫外線照射處理時間大于15 min時抑菌率逐漸下降。利用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)時，菌株G10形成的生物膜D570 nm平均值為1.125，利用Landy培養(yǎng)基培養(yǎng)時，D570 nm平均值為1.632。有研究顯示，生防菌生物膜的形成能力與其防效呈正相關(guān)[9-10]。內(nèi)生細菌G10菌株為芽孢桿菌，利用其產(chǎn)芽孢的優(yōu)勢，相對耐受不良環(huán)境的能力強，結(jié)合以往關(guān)于該菌對芝麻立枯病生防的研究，該菌在芝麻苗根部定殖能力強，溫室試驗防效為80%，田間小區(qū)試驗防效為61%；該菌株有作為生防制劑的開發(fā)潛力。

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