宋起濱，王哲，王宇令，李楊，林爽

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院 1. 整形美容科； 2. 病理科，沈陽(yáng) 110004）

雖然周?chē)窠?jīng)損傷后具有一定的再生潛能，但是一般情況下?lián)p傷的周?chē)窠?jīng)很難實(shí)現(xiàn)完全的再生［1］。周?chē)窠?jīng)損傷后，施萬(wàn)細(xì)胞可以快速地從成髓鞘狀態(tài)向生長(zhǎng)支持的形態(tài)轉(zhuǎn)換，損傷的神經(jīng)遠(yuǎn)端會(huì)有大量的施萬(wàn)細(xì)胞增殖，增殖的同時(shí)施萬(wàn)細(xì)胞會(huì)向近端遷移構(gòu)成基底膜束或者形成Bungner帶，一般情況下，在損傷3 d后施萬(wàn)細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)換會(huì)達(dá)到高峰。施萬(wàn)細(xì)胞能夠分泌大量的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)分子，刺激周?chē)窠?jīng)再生，促進(jìn)軸突生長(zhǎng)。但因施萬(wàn)細(xì)胞自體來(lái)源有限，作用時(shí)間較短，導(dǎo)致神經(jīng)損傷難以完全再生［2-4］。

干細(xì)胞是組織工程與再生醫(yī)學(xué)中常用的種子細(xì)胞，具有快速自我更新和多向分化的能力。其中，脂肪源性干細(xì)胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）因具有產(chǎn)量高、獲取過(guò)程損傷小等優(yōu)勢(shì)而被廣泛應(yīng)用。研究［5］發(fā)現(xiàn)促有絲分裂和分化因子可以誘導(dǎo)ADSCs向類(lèi)似施萬(wàn)細(xì)胞分化，分化后的細(xì)胞能夠表達(dá)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物和營(yíng)養(yǎng)因子受體。但也有研究［6-7］指出ADSCs很難分化成完全的施萬(wàn)細(xì)胞，其旁分泌功能對(duì)周?chē)窠?jīng)再生的作用要遠(yuǎn)大于分化功能。

本研究將大鼠神經(jīng)施萬(wàn)細(xì)胞用ADSCs條件培養(yǎng)基培養(yǎng)或與ADSCs共培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)ADSCs條件培養(yǎng)基及ADSCs共培養(yǎng)均能促進(jìn)大鼠神經(jīng)施萬(wàn)細(xì)胞的增殖及分泌功能，為周?chē)窠?jīng)再生的研究提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：4周齡健康成年SD大鼠，體質(zhì)量90～130 g，用于分離培養(yǎng)ADSCs，由我院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。本實(shí)驗(yàn)獲得我院動(dòng)物倫理委員會(huì)審批。

1.1.2 主要試劑：大鼠神經(jīng)施萬(wàn)細(xì)胞（沈陽(yáng)匯佰生物有限公司）；Ⅱ型膠原酶（美國(guó)Sigma公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程有限公司），DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone公司），胰蛋白酶（美國(guó)Corning公司），四甲基偶氮唑藍(lán)（北京匯佰生物有限公司），F(xiàn)ITC標(biāo)記的抗大鼠CD31、CD90、CD45和CD44（美國(guó)BD公司），神經(jīng)生長(zhǎng)因子（nerve growth factor，NGF）、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（glial cell line derived neurotrophic factor，GDNF）、血 管 內(nèi) 皮 生 長(zhǎng)因 子（vascular endothelial growth factor，VEGF） 和GAPDH抗體（美國(guó)Santa Cruz公司），二抗、ELISA試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），SYBR試劑盒（日本TaKaRa公司）。

1.2 方法

1.2.1 ADSCs分離培養(yǎng)：用Hanks液清洗SD大鼠雙側(cè)腹股溝區(qū)脂肪，剪碎脂肪，加入Ⅱ型膠原酶，37℃消化40 min。培養(yǎng)基終止消化后1 000 r/min離心5 min，用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，吹打均勻，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。此后每2～3 d換液1次，待細(xì)胞融合至90%時(shí)用胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)：將大鼠神經(jīng)施萬(wàn)細(xì)胞接種于含10%滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 ADSCs表面標(biāo)記物鑒定：取第三代ADSCs消化離心計(jì)數(shù)后，用PBS將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)為5×105/mL。取500 μ L細(xì)胞懸液，分別加入FITC標(biāo)記的CD31、CD90、CD45和CD44抗體（PBS作為對(duì)照），4 ℃孵育30 min，PBS洗1次，PBS重懸細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.4 ADSCs條件培養(yǎng)基獲取：待第三代ADSCs在完全培養(yǎng)基中達(dá)到90%融合時(shí)，更換為含1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集培養(yǎng)液，0.22 μ L濾器過(guò)濾，獲得ADSCs條件培養(yǎng)基。

1.2.5 ADSCs與大鼠神經(jīng)施萬(wàn)細(xì)胞的間接培養(yǎng)：將大鼠神經(jīng)施萬(wàn)細(xì)胞接種于transwell下室中，實(shí)驗(yàn)組在transwell上室中接種200 μ L濃度為5×105/mL的ADSCs，對(duì)照組則不添加ADSCs。

1.2.6 ELISA：按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)，使用雙抗體夾心法，包被上樣，加抗體，底物顯色，通過(guò)酶標(biāo)儀分析結(jié)果。

1.2.7 MTT實(shí)驗(yàn)：將用ADSCs條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)施萬(wàn)細(xì)胞以1×104/mL濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，終體積200 μ L，以正常培養(yǎng)基培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)施萬(wàn)細(xì)胞作為對(duì)照。待細(xì)胞貼壁后，于0、12、24、36和48 h（每個(gè)濃度、每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別設(shè)3個(gè)復(fù)孔）分別加入5 mg/mL MTT溶液10 μ L，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，棄上清，每孔中加入200 μ L DMSO，震蕩10 min，在490 nm處記錄吸光值。于0、12、24、36和48 h（每個(gè)濃度、每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別設(shè)3個(gè)復(fù)孔）在與ADSCs共培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)施萬(wàn)細(xì)胞中加入5 mg/mL MTT溶液10 μ L，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，棄上清，每孔中加入200 μ L DMSO，震蕩10 min，在490 nm處記錄吸光值。

1.2.8 Western blotting：細(xì)胞培養(yǎng)48 h后使用RIPA裂解液搜集并裂解細(xì)胞，提取蛋白，通過(guò)G250定量后，取30 μ g蛋白進(jìn)行電泳（80～120V）、轉(zhuǎn)膜（100 V，1 h）后，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。加入一抗4 ℃過(guò)夜后，TBST清洗3次。二抗室溫孵育1 h后，TBST清洗3次。ECL發(fā)光。

1.2.9 實(shí)時(shí)PCR：TRIZOL法提取培養(yǎng)48 h的大鼠神經(jīng)施萬(wàn)細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)。NGF正向引物序列為5’-ATGTCCATGTTGTTCT AC-3’，反向引物序列為5’-CAGCCTCTTCTTGCAGC C-3’；BDNF 正向引物序列為5’-GACCATCCTTTTC CTTAC-3’，反向引物序列為5’-CTATCTTCCCCTTTT AATGG-3’；GDNF 正向引物序列為5’-GAACCAAGC CAGTGTATCTCC-3’，反向引物序列為5’-CGTCTCT GCCTTTGTCCTC-3’；VEGF正向引物序列為5’-GAT GAAGCCCTGGAGTGC-3’，反向引物序列為5’-GGT GGTGTGGTGGTGACAT-3’；GAPDH 正向引物序列為5’-GGCAAATTCAACGGCACAGT-3’，反向引物序列為5’-TAGGGCCTCTCTTGCTCAGT-3’。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用非配對(duì)t檢驗(yàn)比較2組數(shù)據(jù)，P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ADSCs細(xì)胞鑒定

流式分析結(jié)果顯示，所提取的細(xì)胞CD31陰性（0.38%），CD45陰 性（17.53%），CD44陽(yáng) 性（92.31%），CD90陽(yáng)性（96.42%），證明ADSCs細(xì)胞提取培養(yǎng)成功。見(jiàn)圖1。

圖1 ADSCs表面抗原標(biāo)記物檢測(cè)Fig.1 Detection of surface antigen markers on ADSCs

2.2 ADSCs條件培養(yǎng)基中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的檢測(cè)

通過(guò)ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，ADSCs條件培養(yǎng)基中含有大量常見(jiàn)的與神經(jīng)再生相關(guān)的因子，其中，NGF、BDNF、GDNF、VEGF的含量分 別為（85.12±1.92）、（184.22±18.32）、（96.97±1.39）、（488.18±4.82）pg/mL，均明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 不同培養(yǎng)基中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的含量Fig.2 Contents of neurotrophic factors in different mediums

2.3 ADSCs條件培養(yǎng)基及ADSCs對(duì)大鼠神經(jīng)施萬(wàn)細(xì)胞增殖的影響

MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，ADSCs條件培養(yǎng)基可以明顯促進(jìn)大鼠神經(jīng)施萬(wàn)細(xì)胞增殖（圖3A）；與ADSCs共培養(yǎng)也可促進(jìn)大鼠神經(jīng)施萬(wàn)細(xì)胞的增殖（圖3B）。

2.4 不同濃度ADSCs對(duì)大鼠神經(jīng)施萬(wàn)細(xì)胞中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)的影響

Western blotting與實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，使用ADSCs條件培養(yǎng)基培養(yǎng)或與ADSCs共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)組大鼠神經(jīng)施萬(wàn)細(xì)胞中NGF、BDNF、GDNF和VEGF蛋白及mRNA表達(dá)水平均增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜ 0.05），提示用條件培養(yǎng)基培養(yǎng)或與ADSCs共培養(yǎng)大鼠神經(jīng)施萬(wàn)細(xì)胞能夠促進(jìn)細(xì)胞中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)，見(jiàn)圖4、5。

3 討論

圖3 ADSCs條件培養(yǎng)基及ADSCs共培養(yǎng)對(duì)大鼠神經(jīng)施萬(wàn)細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effects of medium conditioned with ADSCs or co-cultured with ADSCs on the proliferation of Schwann cells

圖4 ADSCs條件培養(yǎng)基對(duì)大鼠神經(jīng)施萬(wàn)細(xì)胞中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)的影響Fig.4 Effects of medium conditioned with ADSCs on the expression of neurotrophic factor in rat Schwann cells

圖5 ADSCs共培養(yǎng)對(duì)大鼠神經(jīng)施萬(wàn)細(xì)胞中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)的影響Fig.5 The expression of neurotrophic factors in rat Schwann cells when co-cultured with ADSCs

干細(xì)胞能夠促進(jìn)周?chē)窠?jīng)的再生，但其作用機(jī)制目前尚不清楚［8］。研究［9-11］表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及ADSCs可以分化為施萬(wàn)細(xì)胞，進(jìn)而在神經(jīng)修復(fù)中發(fā)揮重要作用，但也有研究認(rèn)為干細(xì)胞所分化出的施萬(wàn)細(xì)胞僅為類(lèi)施萬(wàn)細(xì)胞，僅具有施萬(wàn)細(xì)胞的表型，并不能夠在體內(nèi)發(fā)揮施萬(wàn)細(xì)胞的生理功能。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)［12］證明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及ADSCs移植到坐骨神經(jīng)損傷處后，僅有極小部分能夠分化成施萬(wàn)細(xì)胞，對(duì)整體的神經(jīng)修復(fù)作用不大。目前，大多數(shù)研究［13］認(rèn)為，在促進(jìn)周?chē)窠?jīng)損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用的是干細(xì)胞的旁分泌作用，為了明確ADSCs在外周神經(jīng)損傷修復(fù)中的作用，本研究在獲取大鼠ADSCs后，分別將大鼠神經(jīng)施萬(wàn)細(xì)胞用ADSCs條件培養(yǎng)基培養(yǎng)或與ADSCs共培養(yǎng)，并檢測(cè)了ADSCs對(duì)大鼠神經(jīng)施萬(wàn)細(xì)胞的影響。

很多細(xì)胞因子能夠在周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。周?chē)窠?jīng)受損后NGF表達(dá)上調(diào)，可以促進(jìn)信號(hào)的傳遞以及軸突的生長(zhǎng)；周?chē)窠?jīng)損傷后，BDNF的表達(dá)也有一定程度的上升，BDNF可以促進(jìn)周?chē)窠?jīng)髓鞘的形成；周?chē)窠?jīng)受損后，GDNF表達(dá)大量增加，促進(jìn)感覺(jué)神經(jīng)等的再生［14］；新生血管能夠?yàn)樯窠?jīng)再生提供營(yíng)養(yǎng)，VEGF的表達(dá)可以促進(jìn)血管的再生，也可以刺激軸突的生長(zhǎng)，促進(jìn)施萬(wàn)細(xì)胞的增殖并抑制其凋亡［15-16］。本研究通過(guò)ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ADSCs條件培養(yǎng)基中含有大量的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，這些成分都可以促進(jìn)周?chē)窠?jīng)的再生，促進(jìn)大鼠神經(jīng)施萬(wàn)細(xì)胞的增殖。

本研究還發(fā)現(xiàn)，ADSCs條件培養(yǎng)基和ADSCs細(xì)胞共培養(yǎng)均可促進(jìn)大鼠神經(jīng)施萬(wàn)細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)該細(xì)胞中NGF、BDNF、GDNF和VEGF的表達(dá)。提示ADSCs不僅自身能夠分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，還能促進(jìn)大鼠神經(jīng)施萬(wàn)細(xì)胞增殖并分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。

綜上所述，ADSCs可以分泌大量有利于周?chē)窠?jīng)再生的生長(zhǎng)因子，ADSCs及其條件培養(yǎng)基能促進(jìn)大鼠神經(jīng)施萬(wàn)細(xì)胞增殖并分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，從而有助于周?chē)窠?jīng)的再生。

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