王海英，李慧源，羅紅月，張慧予，姜揚(yáng)，郭利晴，陶蕾，孫曉紅

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，沈陽(yáng) 110032）

阿爾茨海默病 （Alzheimer’s disease，AD） 是癡呆最常見(jiàn)的原因，是一個(gè)日益增長(zhǎng)的全球健康問(wèn)題，對(duì)個(gè)人和社會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［1］。AD的病理學(xué)標(biāo)志包括老年斑細(xì)胞外沉積，細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)纖維元纏結(jié)和膽堿能神經(jīng)元的損傷以及大腦皮層、海馬和認(rèn)知功能所必需的其他腦區(qū)域中的突觸改變。目前研究［2-5］可知多種因素，如炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬、氧化應(yīng)激、興奮毒性和能量代謝穩(wěn)態(tài)紊亂，都可推動(dòng)AD的進(jìn)展。目前尚無(wú)確定的能逆轉(zhuǎn)認(rèn)知功能缺損的藥物，針對(duì)AD發(fā)病機(jī)制不同靶點(diǎn)的藥物開(kāi)發(fā)尚處于試驗(yàn)階段。而關(guān)于青蒿素 （artemisinin，ART） 在AD中的抗炎作用研究較少，故本研究擬探討ART對(duì)AD細(xì)胞模型的抗炎作用，分析ART對(duì)AD的干預(yù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

ART標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司，BV2 小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心，DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰酶購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，胎牛血清購(gòu)自德國(guó)Sera Pro公司，A β25-35購(gòu)買(mǎi)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，CCK8試劑購(gòu)自中國(guó)Biosharp公司，RIPA buffer裂解緩沖液、BCA試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所，PMSF 購(gòu)自中國(guó)Roche公司，ECL超敏發(fā)光液購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)公司，抗體均購(gòu)自萬(wàn)類(lèi)生物技術(shù)有限公司。

1.2 BV2小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)

BV2 小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞在含 10%胎牛血清，10%青霉素 （100 U/mL） 和鏈霉素 （0.1 mg/mL） 的DMEM中培養(yǎng)，放入37 ℃、5 % CO2的孵箱中。每2 d 換液1次，當(dāng)細(xì)胞鋪滿(mǎn)瓶底的80%～90%時(shí)傳代進(jìn)行。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 A β25-35的處理

二甲基亞楓 （dimethyl sub-maple，DMSO） 溶解人工合成的A β25-35晶體，用高壓滅菌的雙蒸水稀釋至母夜?jié)舛?（100 μ mol/L） 。37 ℃、7 d后老化為A β25-35纖維體。制作完成后-40 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 BV2小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)細(xì)胞模型的建立

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞以5×103/mL于96孔板中培養(yǎng)，將A β25-35依照濃度梯度 （10 μ mol/L、20 μ mol/L和40 μ mol/L） 加入培養(yǎng)基中。24 h后進(jìn)行CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活力，選取最佳A β25-35濃度，根據(jù)選定的濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 ART對(duì)BV2細(xì)胞的毒性反應(yīng)實(shí)驗(yàn)

BV2細(xì)胞以5×103/mL接種于96孔板中，每孔100 μ L，培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度的ART （0.01、0.1、1、10、20、40、60、80 μ mol/L） 繼續(xù)培養(yǎng)24 h，采用CCK8法檢測(cè)ART對(duì)BV2細(xì)胞的毒性。每次實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.6 Western blotting檢 測(cè)ART對(duì)BV2細(xì) 胞NF-κB信號(hào)通路蛋白表及炎癥誘導(dǎo)酶表達(dá)的影響

BV2細(xì)胞以5×105個(gè)/孔密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后，使用A β25-35誘導(dǎo)細(xì)胞前加入不同濃度的青蒿素預(yù)處理1 h，A β25-35終濃度為10 μ mol/L。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，棄掉6孔板中舊培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗3遍，加入RIPA裂解液 （加入1% PMSF） ，冰上裂解20 min后，用移液槍吹打細(xì)胞后移至1.5 mL EP管中，4℃，12 000 g離心15 min。BSA法測(cè)定蛋白濃度，之后進(jìn)行凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，4 ℃一抗過(guò)夜，二抗孵育1 h后，進(jìn)行ECL顯影，計(jì)算灰度值。

1.7 實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)促炎性因子白細(xì)胞介素1 β （interleukin 1 β，IL-1 β） ，腫瘤壞死因子α （tumor necrosis factor α，TNF-α） 的mRNA表達(dá)水平

收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總mRNA。應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)在實(shí)時(shí) PCR儀上進(jìn)行，最終數(shù)據(jù)用2-△△Ct法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料結(jié)果用x-±s表示，P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ART、A β25-35對(duì)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞活力的影響

通過(guò)CCK8法檢測(cè)到ART劑量范圍為0.01～10 μ mol/L時(shí)，對(duì)細(xì)胞不具有顯著的毒性反應(yīng)，因此選擇ART最低和最高有效濃度 （0.01和10 μ mol/L） 用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。而A β25-35≤10 μ mol/L時(shí)細(xì)胞活力無(wú)顯著變化，因而選擇10 μ mol/L作為A β25-35的有效作用濃度。因此實(shí)驗(yàn)分組為空白對(duì)照組 、模型組、ART低濃度組 （ART 0.01 μ mol/L） 和ART高濃度組 （ART 10 μ mol/L） ，見(jiàn)圖1。

2.2 ART對(duì)炎癥誘導(dǎo)酶一氧化氮合成酶 （nitric oxide synthase，iNOS） 和環(huán)氧合酶2 （cyclooxygenase-2，COX-2） 蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，10 μ mol/L A β25-35處理BV2細(xì)胞24 h，iNOS和COX-2表達(dá)量顯著增加。而通過(guò)ART預(yù)處理BV2細(xì)胞iNOS和COX-2表達(dá)呈劑量依賴(lài)性降低，見(jiàn)圖2。

圖1 不同濃度的 A β25-35、ART對(duì)BV2細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effects of different concentrations of A β25-35 and ART on the viability of BV2 cells

2.3 ART對(duì)NF-κB通路蛋白表達(dá)的影響

通過(guò)免疫印跡分析，證明ART可調(diào)控BV2細(xì)胞中NF-κB活化。ART預(yù)處理BV2小膠質(zhì)細(xì)胞，P-P65、p-IKB α的蛋白表達(dá)量呈明顯下降趨勢(shì)，P65、IKB α的表達(dá)量呈明顯上升趨勢(shì)，見(jiàn)圖3。

2.4 ART對(duì)炎性因子mRNA表達(dá)的影響

實(shí)時(shí)PCR結(jié)果表明，ART可減弱A β25-35誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子如TNF-α和IL-1 β mRNA的表達(dá)，并可促進(jìn)抑炎因子 （IL-10） mRNA的表達(dá)。見(jiàn)圖4。

3 討論

目前AD發(fā)病機(jī)制尚不明確，現(xiàn)有研究證明，炎癥反應(yīng)參與AD的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。A β25-35激活的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)NF-κB通路活化分泌許多促炎細(xì)胞因子，如IL-1 β、TNF-α［6］，并且NF-κB通路活化的信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)于NALP3炎癥小體的激活是必需的［7］。

圖2 不同實(shí)驗(yàn)組iNOS 和 COX-2蛋白的表達(dá)Fig.2 The expression of iNOS and COX-2

圖3 不同實(shí)驗(yàn)組對(duì)NF-κB通路活化的影響Fig.3 Effects of different experimental groups on activation of NF-κB pathway

圖4 不同實(shí)驗(yàn)組TNF-α、IL-1 β、IL-10 mRNA表達(dá)結(jié)果Fig.4 Expression of TNF-α，IL-1 β，IL-10 mRNA in different experimental groups

ART除了具有抗瘧作用外［8］，還具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗真菌等作用。通過(guò)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究［9］發(fā)現(xiàn)，ART還具有以下作用：（1） 減少神經(jīng)炎斑塊負(fù)荷； （2） 通過(guò)抑制β分泌酶活性調(diào)節(jié)APP生成；（3） 通過(guò)NF-κB通路抑制APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠NALP3炎癥小體的激活。

NF-κB信號(hào)通路主要參與機(jī)體防御反應(yīng)、組織損傷和應(yīng)激、細(xì)胞分化和調(diào)亡以及腫瘤生長(zhǎng)抑制過(guò)程等的信息傳遞。NF-κB在細(xì)胞質(zhì)中與抑制性蛋白質(zhì)結(jié)合形成無(wú)活性的復(fù)合物。當(dāng)TNF等作用于相應(yīng)受體后，可通過(guò)第二信使激活此系統(tǒng)，而病毒感染、脂多糖、活性氧中間體、雙鏈RNA等則可直接激活NF-κB。激活過(guò)程是通過(guò)磷酸化抑制性蛋白使其構(gòu)象改變，從而使得NF-κB得以活化?；罨腘F-κB進(jìn)入細(xì)胞核，與DNA接觸，并啟動(dòng)或抑制有關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。本研究結(jié)果顯示，在沒(méi)有受到刺激的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞中，大部分的NF-κB二聚體通過(guò)與IKB α結(jié)合而以無(wú)活性的狀態(tài)存在，當(dāng)細(xì)胞受到刺激后，可使IKB α發(fā)生磷酸化，并從NF-κB上解離出來(lái)，NF-κB因此具有轉(zhuǎn)錄活性。 NF-κB途徑是神經(jīng)炎癥關(guān)鍵介質(zhì)之一。本研究支持ART對(duì)A β25-35介導(dǎo)的NF-κB活化具有抑制作用。

AD炎癥進(jìn)展的一個(gè)中心特征是活化的小膠質(zhì)細(xì)胞聚集在聚集A β肽斑塊周?chē)?。小膠質(zhì)細(xì)胞激活表明持續(xù)的慢性炎癥過(guò)程。小膠質(zhì)細(xì)胞刺激通過(guò)釋放一氧化氮，iNOS，COX-2，IL-1 β，TNF-α等因子而發(fā)揮神經(jīng)毒性作用，從而導(dǎo)致炎癥的發(fā)生。一氧化氮是主要產(chǎn)物，其產(chǎn)生受iNOS的調(diào)控，iNOS在激活的巨噬細(xì)胞中高度表達(dá)，引起炎性和自身免疫疾病中的器官破壞。而COX-2在前列腺素E2生成中起關(guān)鍵酶作用，同時(shí)導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子釋放和形成腦水腫。許多研究［10-12］通過(guò)抑制激活的BV2細(xì)胞中的iNOS和COX-2來(lái)進(jìn)行抗炎調(diào)節(jié)。同樣地，本研究顯示，ART可抑制A β25-35誘導(dǎo)活化的BV2細(xì)胞中的iNOS和COX-2炎癥介質(zhì)的表達(dá)。

ART可顯著抑制NF-κ B通路活化，導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子 （TNF-α，IL-1 β） 生成減少、抑炎因子 （IL-10）的表達(dá)增加，并抑制炎癥誘導(dǎo)酶表達(dá)。本研究首先證明了ART在AD細(xì)胞模型中的抗炎作用。

總而言之，本研究揭示了ART抑制AD炎癥反應(yīng)細(xì)胞模型的作用。ART抑制NF-κB通路蛋白磷酸化進(jìn)而調(diào)控炎性細(xì)胞因子及炎癥酶表達(dá)減少炎癥反應(yīng)的發(fā)生，表明ART可能是治療AD的潛在治療藥物。今后應(yīng)進(jìn)一步探討其療效和安全性。

［1］ APOSTOLOVA LG. Alzheimer disease ［J］. Minneap Minn，2016，22（2） ：419-434. DOI：10.1212/CON.0000000000000307.

［2］ LIN XY，BAI G，LIN L，et al. Vaccination induced changes in pro-inflammatory cytokine levels as an early putative biomarker for cognitive improvement in a transgenic mouse model for Alzheimer disease［J］. Hum Vaccin Immunother，2014，10 （7） ：2024-2031. DOI：10.4161/hv.28735.

［3］ WANG XJ，CAO Q，ZHANG Y，et al. Activation and regulation of caspase-6 and its role in neurodegenerative diseases ［J］. Annu Rev Pharmacol Toxicol，2015，55 （5） ：53-72. DOI：10.1146/annurev-pharmtox-010814-124414.

［4］ GASIOROWSKI K，BROKOS B，LESZEK J，et al. Insulin resistance in Alzheimer disease：p53 and microRNAs as important players［ J］.Curr Top Med Chem，2017，17（ 12） ：1429-1437. DOI：10.2174/1568 026617666170103161233.

［5］ VALLE A，LECARPENTIER Y，GUILLEVIN R，et al. Reprogramming energetic metabolism in Alzheimer’s disease［ J］. Life Sci，2018，15（ 193） ：141-152. DOI：10.1016/j.lfs.

［6］ RAHA S，LEE HJ，YUMNAM S，et al. Vitamin D2 suppresses amyloidβ- 25-35 induced microglial activation in BV2 cells by blocking the NF-κB inflammatory signaling pathway［ J］. Life Sci，2016，15（161） ：37-44. DOI：10.1016/j.lfs.

［7］ CHO MH，CHO K，KANG HJ，et al. Autophagy in microglia degrades extracellular β-amyloid fibrils and regulates the NLRP3 inflammasome［ J］. Autophagy，2014，10（ 10） ：1761-1775. DOI：10.4161/auto.29647.

［8］ TAMBO E，KHATER EI，CHEN JH，et al. Nobel prize forthe artemisinin and ivermectin discoveries：a great boost towards elimination of the global infectious diseases of poverty［ J］. Infect Dis Poverty，2015，28（ 4） ：58. DOI：10.1186/s40249-015-0091-8.

［9］ SHI JQ，ZHANG CC，SUN XL，et al. Antimalarial drug artemisinin extenuates amyloid ogenesis and neuroinflammation in APPswe/PS-1dE9 transgenic mice via inhibition of nuclear factor-κB and NLRP3 inflammasome activation［ J］. CNS Neurosci Ther，2013，19（ 4） ：262-268. DOI：10.1111/cns.12066.

［10］ CAI Z，HUSSAIN MD，YAN LJ，et al. Microglia，neuroinflammation，and beta-amyloid protein in Alzheimer’s diseas［eJ］. Int J Neurosci，2014，124 （ 5） ：307-321. DOI：10.3109/00207454.2013.833510.

［11］ SKLYAROV AY，PANASYUK NB，F(xiàn)OMENKO IS，et al. Role of nitric oxide-synthase and cyclooxygenase/lipooxygenase systems in development of experimental ulcerative colitis［ J］. J Physiol Pharmacol，2011，62（ 1） ：65-73.

［12］ BOZIC I，SAVIC D，LAKETA D，et al. Benfotiamine attenuates inflammatory response in LPS stimulated BV-2 microglia［ J］. PLoS One，2015，10（ 2） ：e0118372. DOI：10.1371/journal.pone.0118372.eCollection 2015.