范安妮,佘之蘊(yùn),張 娟,周臣清,梁宇斌

(廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院,廣東順德 528300)

核酸擴(kuò)增是分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的一項(xiàng)重要技術(shù),目前已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷、食品檢測(cè)、動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫等行業(yè)中。核酸擴(kuò)增技術(shù)分為變溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)兩大類。傳統(tǒng)的核酸擴(kuò)增技術(shù)以變溫?cái)U(kuò)增技術(shù)為主,包括常規(guī)PCR、梯度PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、巢式PCR、多重PCR等,擴(kuò)增過(guò)程需循環(huán)經(jīng)歷變性、退火、延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟,每個(gè)步驟的反應(yīng)溫度不一,因此擴(kuò)增過(guò)程依賴專業(yè)儀器設(shè)備進(jìn)行,同時(shí)由于反復(fù)調(diào)溫,導(dǎo)致反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)。隨著分子生物學(xué)研究的不斷深入,Notomi等[1]建立了一種新型的核酸擴(kuò)增技術(shù):環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)。LAMP是利用能識(shí)別靶序列上的6個(gè)位點(diǎn)的4個(gè)特殊設(shè)計(jì)的引物和一種鏈置換活性的DNA聚合酶,在恒溫條件下特異、高效、快速地在體外擴(kuò)增核酸的新技術(shù)。與傳統(tǒng)變溫核酸擴(kuò)增技術(shù)相比,LAMP僅需簡(jiǎn)單便宜的恒溫器(水浴、金屬浴、恒溫箱等)即可完成反應(yīng),操作簡(jiǎn)單,反應(yīng)的結(jié)果通過(guò)肉眼觀察白色渾濁或綠色熒光的生成來(lái)判斷,也可通過(guò)熒光信號(hào)監(jiān)測(cè)來(lái)判斷,符合食品快速檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需要,在食品檢測(cè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。本文重點(diǎn)介紹LAMP技術(shù)在食品微生物檢測(cè)、轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)、過(guò)敏原成分檢測(cè)和動(dòng)物源性成分檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用研究進(jìn)展,以期為食品快速、高通量檢測(cè)技術(shù)建立提供參考。

1 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在食品微生物檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用

食源性致病微生物一直是引發(fā)食品安全事故的主要因素[2],其產(chǎn)生的疾病嚴(yán)重危害公眾健康,因此被列為食品衛(wèi)生安全檢測(cè)的重要指標(biāo)[3]。開展快速、便捷的食源性致病菌檢驗(yàn)技術(shù)的研究,防止被污染的食品進(jìn)入市場(chǎng),對(duì)保障消費(fèi)者健康安全有著極為重要的意義。

1.1 LAMP技術(shù)在檢測(cè)食品中沙門氏菌方面的應(yīng)用

沙門氏菌可分離于豬肉、牛肉、雞肉及其加工產(chǎn)品中,是常見的病原菌之一[4-6]?，F(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.4-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》是采用培養(yǎng)法進(jìn)行檢測(cè),整個(gè)過(guò)程需要2～3個(gè)工作日,如有可疑菌落,還需要做生化鑒別。王瑾等[7]根據(jù)沙門氏菌invA基因序列設(shè)計(jì)了特異性LAMP引物,建立了沙門氏菌LAMP檢測(cè)方法,該方法檢測(cè)過(guò)程僅需45 min,靈敏度達(dá)到6 CFU/管,其靈敏度和準(zhǔn)確性與國(guó)標(biāo)法相當(dāng),但是檢測(cè)時(shí)間大大縮短。黃金海等[8]根據(jù)沙門氏菌invA基因設(shè)計(jì)一組環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物,檢測(cè)7種不同血清型沙門氏菌和4種非沙門氏菌,并與活菌計(jì)數(shù)法比較,結(jié)果表明該方法具有較高的特異性與靈敏性,適用于沙門氏菌污染食品的快速檢測(cè)。吳家林等[9]對(duì)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)沙門氏菌的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化,包括dNTP濃度,MgCl2濃度,外引物濃度和內(nèi)引物濃度,優(yōu)化后該方法對(duì)細(xì)菌純培養(yǎng)物檢測(cè)的靈敏度達(dá)到101CFU/mL。有研究表明,環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)食品中沙門氏菌的符合率為98%,明顯優(yōu)于常規(guī)PCR技術(shù)(90%)[10]。

1.2 LAMP技術(shù)在檢測(cè)食品中阪崎腸桿菌方面的應(yīng)用

阪崎腸桿菌為革蘭氏陰性菌,產(chǎn)黃色毒素,可引起新生兒腦膜炎、菌血癥、敗血癥等嚴(yán)重疾病。我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)明確規(guī)定,適合0～6月齡嬰兒配方食品不得檢出阪崎腸桿菌。胡連霞等[11]以阪崎腸桿菌的16S-23S rRNA區(qū)間序列作為靶序列,設(shè)計(jì)了一套LAMP引物,包括內(nèi)引物、外引物和環(huán)引物。該方法檢測(cè)阪崎腸桿菌的靈敏度達(dá)到0.101 CFU/mL,人工污染阪崎腸桿菌的嬰兒配方奶粉的檢出限為1.1 CFU/g,而PCR方法對(duì)照檢測(cè)阪崎腸桿菌的檢出限為1.1 CFU/g,人工污染阪崎腸桿菌的嬰兒配方奶粉的檢出限為11000 CFU/g,靈敏度明顯低于LAMP。而且LAMP檢測(cè)從樣品處理到報(bào)告結(jié)果,僅需1 h,結(jié)果肉眼可判讀,方便快捷。董鑫悅等[12]以阪崎腸桿菌OmpA序列為靶基因設(shè)計(jì)引物,并對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化,該新建方法檢測(cè)阪崎腸桿菌純培養(yǎng)物的靈敏度是PCR方法的10倍,特異性好。

1.3 LAMP技術(shù)在檢測(cè)食品中蠟樣芽孢桿菌方面的應(yīng)用

蠟樣芽孢桿菌生存范圍廣,富含蛋白質(zhì)和碳水化合物的食品,更容易受污染,由于蠟樣芽孢桿菌具有致病性,因此容易引發(fā)食物中毒[13-15]。賈雅菁等[16]根據(jù)已公布的蠟樣芽胞桿菌hblA基因序列設(shè)計(jì)內(nèi)外引物,利用SYBRGreen I作為染料進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光監(jiān)測(cè),該方法檢測(cè)純菌的靈敏度達(dá)到8.2 CFU/mL,反應(yīng)時(shí)間僅需20 min,同時(shí)采用21株致病菌(4株蠟樣芽孢桿菌和17株非蠟樣芽孢桿菌)進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn),該方法能夠進(jìn)行準(zhǔn)確判讀。

1.4 LAMP技術(shù)在檢測(cè)食品中單增李斯特菌方面的應(yīng)用

單增李斯特菌是一種常見的人畜共患的食源性致病菌,可引發(fā)腦膜炎、敗血癥等嚴(yán)重疾病。其在4 ℃的環(huán)境中仍可生長(zhǎng)繁殖,因此是冷藏食品中最主要的致病菌[17-18]。張?bào)w銀等[19]根據(jù)單增李斯特菌hly基因的保守序列設(shè)計(jì)特異性LAMP引物,LAMP反應(yīng)在65 ℃下進(jìn)行,1 h內(nèi)即可檢出單增李斯特菌,結(jié)果表明該方法靈敏度達(dá)到100 CFU/mL,對(duì)13株致病菌以及50種樣品進(jìn)行特異性檢測(cè),同時(shí)與國(guó)標(biāo)方法進(jìn)行比較,符合率達(dá)到100%,可滿足大批量樣品快速篩選的要求。

綜上所述,與國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法相比,使用LAMP技術(shù)檢測(cè)食源性致病菌,檢測(cè)時(shí)間從3～5 d縮短到1 d即可,為食源性致病菌的快速篩選帶來(lái)極大便利,同時(shí)也提高了檢測(cè)效率。與PCR方法比較,LAMP也顯示出更高的靈敏度。姜侃等[20]建立了一種同時(shí)檢測(cè)沙門氏菌、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的三重LAMP法,分別針對(duì)沙門氏菌invA基因、金黃色葡萄球菌nuc基因、單增李斯特菌hly基因設(shè)計(jì)三套LAMP引物,優(yōu)化反應(yīng)條件,該方法能在90 min內(nèi)一次性檢出以上3種致病菌,檢測(cè)靈敏度是PCR的1000倍。

2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在食品轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用

據(jù)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用國(guó)際服務(wù)組織(ISAAA)統(tǒng)計(jì),2015年全球種植了近1.8億公頃轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物,從1996年轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化到2015年,全球轉(zhuǎn)基因作物累計(jì)種植面積達(dá)到20億公頃,轉(zhuǎn)基因作物也擴(kuò)展到了四大作物(玉米、大豆、棉花和油菜)以外[21]。轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物即利用基因工程技術(shù),將來(lái)源于任何種類的遺傳物質(zhì)引入到不同種類的植物中[22-23],使其通過(guò)遺傳信息的交流以改良農(nóng)藝性狀、提高品質(zhì)性狀,例如抗除草劑大豆、抗除草劑玉米、抗蟲大豆、抗蟲玉米、富含高賴氨酸玉米等[24-26]。隨著農(nóng)業(yè)生物技術(shù)的發(fā)展,為了施行對(duì)轉(zhuǎn)基因作物的有效監(jiān)管,許多國(guó)家和機(jī)構(gòu)都制定了轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)條例,因此建立高效、快速、準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)方法十分關(guān)鍵。

目前常用的食品轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)技術(shù)分為兩大類,一類是蛋白水平的檢測(cè),通過(guò)檢測(cè)外源基因的表達(dá)產(chǎn)物來(lái)判斷。一類是核酸水平的檢測(cè),檢測(cè)的靶基因通常是選擇通用元件或者是外源基因。由于核酸比蛋白質(zhì)穩(wěn)定,對(duì)于經(jīng)過(guò)深加工的轉(zhuǎn)基因食品,核酸水平的檢測(cè)更為廣泛。常規(guī)的PCR方法或?qū)崟r(shí)熒光定量PCR方法對(duì)設(shè)備和人員要求較高,耗時(shí)長(zhǎng),無(wú)法實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè),而LAMP技術(shù)正好彌補(bǔ)了這一缺陷。陳金松等[27]針對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米表達(dá)載體的花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子(CaMV35S)設(shè)計(jì)了一套特異LAMP引物,并對(duì)反應(yīng)體系成分進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果表明，該方法比常規(guī)PCR方法方便快捷、具有更高的靈敏度。閆興華等[28]根據(jù)轉(zhuǎn)基因玉米LY038外源基因cordapA基因設(shè)計(jì)了4條特異性高的LAMP引物,該檢測(cè)體系在63 ℃恒定溫度下反應(yīng)50 min,即可完成檢測(cè),靈敏度達(dá)到0.01%,是常規(guī)PCR方法的5倍。周杰等[29]針對(duì)DAS-81419-2、DP356043-5、A2704-12、FG72、BPSCV127-9和MON89788等6種常見轉(zhuǎn)基因大豆的旁側(cè)序列,分別設(shè)計(jì)了LAMP引物,該方法僅需在恒溫條件下反應(yīng)30 min,即可進(jìn)行結(jié)果判讀,靈敏度達(dá)到0.1%。

綜上,LAMP方法檢測(cè)食品中的轉(zhuǎn)基因成分,比PCR方法具有更高的靈敏度,與PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法相比,反應(yīng)用時(shí)更短,操作更簡(jiǎn)單,將來(lái)有望成為食品轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的主要檢測(cè)技術(shù)。

3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在食品過(guò)敏原成分檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用

食物過(guò)敏是導(dǎo)致皮膚、腸道及呼吸道疾病等多種急性癥狀的重要原因[30],美國(guó)每年急診患者中有43%病人的發(fā)病由食物過(guò)敏引起[31]。目前,治療食物過(guò)敏癥最有效最直接的方法就是避免食用含有過(guò)敏原的食物,這就要求生產(chǎn)商在食品標(biāo)簽上正確標(biāo)示出導(dǎo)致過(guò)敏的成分,以免消費(fèi)者因不知情而誤食引起過(guò)敏。各國(guó)特別是西方發(fā)達(dá)國(guó)家制定了各種法令或條款對(duì)食品過(guò)敏原以及食品標(biāo)簽作出規(guī)定[32-34],國(guó)際食品法典委員會(huì)、美國(guó)、歐盟、日本、澳大利亞、新西蘭及其他國(guó)家對(duì)過(guò)敏原標(biāo)簽都有要求[35-36]。隨著貿(mào)易全球化的發(fā)展、不同地域間食物的相互流通以及深加工技術(shù)的廣泛應(yīng)用[37-40],過(guò)敏人群接觸食物中過(guò)敏原的種類日益增多[41-43],因此開發(fā)出高靈敏度以及快速的食品過(guò)敏原檢測(cè)方法勢(shì)在必行[44-47]。

現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)外常用的檢測(cè)食品過(guò)敏原成分的方法分為兩大類:免疫學(xué)檢測(cè)方法和核酸檢測(cè)方法。核酸檢測(cè)技術(shù)具有靈敏、快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn),經(jīng)過(guò)深加工后的食品,核酸成分仍然保持一定的穩(wěn)定性,因此成為主要的檢測(cè)技術(shù)。本項(xiàng)目組以八大類食物過(guò)敏原(花生、堅(jiān)果、小麥、蝦等)中的典型產(chǎn)品為研究對(duì)象,分別篩選出特異性高的過(guò)敏原基因片段為檢測(cè)對(duì)象,設(shè)計(jì)LAMP引物并優(yōu)化反應(yīng)體系,建立一套快速檢測(cè)食品過(guò)敏原成分的方法。以過(guò)敏原小麥成分檢測(cè)為例,選取GAG56D基因的特異性高的片段,設(shè)計(jì)4條LAMP引物和2條環(huán)引物,在65 ℃進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增1 h,選用SYBR GreenⅠ作為熒光染料,反應(yīng)結(jié)束后,陰性結(jié)果呈現(xiàn)橙色,陽(yáng)性結(jié)果呈現(xiàn)綠色,該方法靈敏度達(dá)到0.01%,對(duì)50份樣品(小麥原料樣品20份,小麥加工制品23份,未含小麥成分樣品7份)進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果與實(shí)時(shí)熒光定量PCR一致,符合率100%,LAMP檢測(cè)時(shí)間大大縮短,操作更簡(jiǎn)單[48]。

4 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在食品動(dòng)物源性成分檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用

肉類食品的安全追溯及種屬鑒別已逐漸受到各國(guó)政府部門、食品生產(chǎn)企業(yè)和消費(fèi)者的關(guān)注。為保證肉類產(chǎn)品質(zhì)量安全,保障消費(fèi)者的合法權(quán)益,避免市場(chǎng)不公平競(jìng)爭(zhēng)現(xiàn)象的發(fā)生,亟待建立一種能快速準(zhǔn)確鑒別、檢測(cè)動(dòng)物源性成分的方法。

當(dāng)前,國(guó)內(nèi)外對(duì)于肉類品種的鑒定方法主要有蛋白質(zhì)鑒定和核酸鑒定兩大類。蛋白質(zhì)技術(shù)鑒定肉類物種的可靠性和穩(wěn)定性較差,無(wú)法滿足現(xiàn)代肉類摻雜摻假檢測(cè)的要求。相比之下,由于DNA的相對(duì)穩(wěn)定性,只要知道動(dòng)物物種的特異性基因或蛋白的基因序列就能實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。宋濤平等[49]根據(jù)雞、鴨、牛、羊物種cytb、cox3、12S rRNA、cytb特異性基因分別設(shè)計(jì)LAMP引物,在63 ℃恒溫條件下反應(yīng)45 min后進(jìn)行結(jié)果判讀,該方法對(duì)熟肉制品摻雜肉檢測(cè)的檢出限達(dá)到0.01%。劉少寧等[50]針對(duì)狐貍線粒體coxⅠ基因設(shè)計(jì)一套LAMP引物并對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行摸索優(yōu)化,從而建立一種能夠快速檢測(cè)出綿羊肉中摻入狐貍源性成分的方法,該方法可檢測(cè)出摻假率為1.0%的羊肉制品。譚貴良等[51]針對(duì)豬、牛、羊、鴨的線粒體cytb基因分別設(shè)計(jì)LAMP引物并優(yōu)化反應(yīng)參數(shù),建立了食用植物油和地溝油中動(dòng)物源性成分的LAMP檢測(cè)方法,該方法可以快速檢測(cè)出混合油脂中的動(dòng)物源性成分,動(dòng)物油脂的檢出限為1%,地溝油的檢出限為5%。與常規(guī)PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法相比,LAMP檢測(cè)方法不需要依賴昂貴的PCR儀,操作簡(jiǎn)單,結(jié)果肉眼可判別,方便快捷,可滿足室外檢測(cè)及現(xiàn)場(chǎng)執(zhí)法的要求。

5 基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的芯片技術(shù)在食品檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用

LAMP技術(shù)作為一種等溫核酸擴(kuò)增技術(shù),以其快速、特異、高效、結(jié)果易于判讀的優(yōu)點(diǎn),廣泛應(yīng)用于食品檢測(cè)領(lǐng)域。常規(guī)的LAMP技術(shù)只能檢測(cè)1～2個(gè)目標(biāo)序列,隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展,基因芯片作為分子生物學(xué)的一個(gè)技術(shù)突破,以其高通量、自動(dòng)化、集成化、微型化的特點(diǎn),具有強(qiáng)大的發(fā)展活力。張國(guó)豪等[52]設(shè)計(jì)了一種基于LAMP原理的微流控芯片,該芯片設(shè)有微反應(yīng)陣列,每張芯片在特定反應(yīng)池包埋固定一套引物用于一種核酸靶序列的擴(kuò)增與檢測(cè),可同時(shí)對(duì)多種核酸靶基因進(jìn)行高通量并行檢測(cè)。目前已有商品化芯片檢測(cè)試劑盒應(yīng)用于食品中多種致病菌的檢測(cè),該試劑盒可定性檢測(cè)3種常見食品致病菌,包括:沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和腸出血性大腸埃希氏菌O157。將食品進(jìn)行增菌后,提取增菌液的核酸作為模板進(jìn)行擴(kuò)增,芯片已經(jīng)包埋了3套引物,一次可檢測(cè)3個(gè)樣本,每個(gè)樣本可同時(shí)定性檢測(cè)3種致病菌。這為食源性致病菌快篩提供了極大的便利。

6 結(jié)論與展望

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)作為一種快速、便捷的核酸檢測(cè)手段,與常規(guī)PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法一起成為食品安全檢測(cè)的重要工具。我國(guó)目前已有基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的食品檢測(cè)系列標(biāo)準(zhǔn):包括出口食品中轉(zhuǎn)基因成分環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)檢測(cè)方法和進(jìn)出口食品中致病菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)檢測(cè)方法。與傳統(tǒng)的PCR方法相比,LAMP的突出優(yōu)勢(shì)在于:不依賴昂貴的PCR儀,僅需恒溫設(shè)備即可;反應(yīng)時(shí)間僅需30～60 min,結(jié)果肉眼可判讀;基于LAMP原理的芯片技術(shù),可實(shí)現(xiàn)對(duì)單一樣品多種靶基因同時(shí)檢測(cè),也可實(shí)現(xiàn)多樣品的高通量檢測(cè)。同樣,該技術(shù)也存在一定的問(wèn)題:LAMP反應(yīng)需要設(shè)計(jì)4條引物,為了加快反應(yīng)速度,通常會(huì)再設(shè)計(jì)2條環(huán)引物,引物設(shè)計(jì)過(guò)程比較復(fù)雜、費(fèi)時(shí);當(dāng)樣品DNA質(zhì)量不高時(shí),LAMP檢測(cè)效果會(huì)低于PCR方法[53];食品中存在的多種水溶性DNA聚合酶抑制劑和脂肪等,會(huì)影響擴(kuò)增效果,因此致病菌的快速檢測(cè)都需要進(jìn)行預(yù)增菌,從而使檢測(cè)時(shí)間變長(zhǎng);利用多重LAMP進(jìn)行多個(gè)靶基因的同時(shí)檢測(cè)時(shí),如何避免引物間的干擾,確保引物的特異性。隨著技術(shù)研究的不斷深入,LAMP技術(shù)有望得到進(jìn)一步優(yōu)化和完善,例如多重LAMP的設(shè)計(jì)、LAMP與芯片技術(shù)的結(jié)合,實(shí)現(xiàn)快速、特異、靈敏、高通量的目的,這將成為核酸檢測(cè)領(lǐng)域的重要工具,可廣泛應(yīng)用于食品安全檢測(cè)、檢驗(yàn)檢疫、衛(wèi)生防疫、疾病診斷等領(lǐng)域,前景非常廣闊。

[1]Notomi T,Okayama H,Masubuchi H,et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J]. Nucleic Acids Research,2000,28(12):e63.

[2]Tzschoppe M,Martin A,Beutin L. A rapid procedure for the detection and isolation of enterohaemorrhagic Escherichia coli(EHEC)serogroup O26,O103,O111,O118,O121,O145 and O157 strains and the aggregative EHEC O104:H4 strain from ready-to-eat vegetables[J]. International Journal of Food Microbiology,2012,152(1-2):19-30.

[3]Lam H M,Remais J,Fung M C,et al. Food supply and food safety issues in China[J]. Lancet,2013,381(9882):2044-2053.

[4]Cossu A,Witkowsky R D,Levin R E. Fat removal with hydrolyzed corn starch for real-time qPCR detection of Salmonella enterica in ground beef in 4.5 hours without enrichment[J]. Food Control,2014,46:475-479.

[5]Park S H,Aydin M,Khatiwara A,et al. Current and emerging technologies for rapid detection and characterization of Salmonella in poultry and poultry products[J]. Food Microbiology,2014,38:250-262.

[7]王瑾,林麗萍,郜彥彥,等. 實(shí)時(shí)熒光環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)雞肉中沙門氏菌[J]. 食品科學(xué),2016,37(24):170-174.

[8]黃金海,孫躍輝,陳瑞,等. 食品沙門氏菌LAMP快速檢測(cè)方法的建立[J]. 天津大學(xué)學(xué)報(bào),2012,45(5):468-472.

[9]吳家林,沙丹,馬廣源,等. 沙門氏菌LAMP檢測(cè)方法的建立[J]. 中國(guó)病原生物學(xué)雜志,2015,10(7):611-614.

[10]孔超,董娜,高偉. 應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法快速檢測(cè)食品中沙門氏菌的研究[J]. 中國(guó)病原生物學(xué)雜志. 2015,10(9):816-818.

[11]胡連霞,張偉,張先舟,等. 改良環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)嬰兒配方奶粉中的阪崎腸桿菌[J]. 微生物學(xué)報(bào),2009,49(3):378-382.

[12]董鑫悅,滿朝新,盧雁,等. 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法快速檢測(cè)乳中阪崎腸桿菌[J]. 食品工業(yè)科技,2013,34(5):318-320.

[13]Mantynen V,Lindstrom K. A rapid PCR-based DNA test for enterotoxic Bacillus cereus[J]. Applied and Environmental Microbiology,1998,64(5):1634-1639.

[14]趙寧,呂琦,姚麗艷,等. 原料乳中蠟樣芽孢桿菌的快速檢測(cè)[J]. 中國(guó)乳品工業(yè),2009,37(9):43-45.

[15]蔣建明. 一起蠟樣芽孢桿菌污染飲水引起食物中毒調(diào)查[J]. 浙江預(yù)防醫(yī)學(xué),2009,21(2):38-39.

[16]賈雅菁,付博宇,王羽,等. 實(shí)時(shí)熒光環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)牛乳中的蠟樣芽孢桿菌[J]. 食品科學(xué),2016,37(6):184-189.

[17]周曉輝,焦新安. 產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌的分子鑒定與亞分型研究[J]. 中國(guó)人獸共患病雜志,2003,19(5):44-47.

[18]Gottlieb S L,Newbem E C,Grifin P M. Multistate outbreak of Listeriosis linked to turkey deli meat and subsequent changes in US regulatory policy[J]. Clinical Infectious Diseases,2006,42(1):2-36.

[19]張?bào)w銀,鄭晶,黃曉蓉,等. 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)食品中的單增李斯特氏菌[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào),2010,10(3):200-204.

[20]姜侃,呂沁風(fēng),汪新,等. 三重LAMP法檢測(cè)食品中沙門氏菌、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌[J]. 食品科學(xué),2013,34(24):182-187.

[21]Clive James. 2015年全球生物技術(shù)/轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化發(fā)展態(tài)勢(shì)[J].中國(guó)生物工程雜志,2016,36(4):1-11.

[22]Zhou J,Berman K H,Breeze M L,et al. Compositional variability in conventional and glyphosate-tolerant soybean(GlycinemaxL.)varieties grown in different regions in Brazil[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2011,59(21):11652-11656.

[23]Esteve A L,Armstrong P R,Tallada J G,et al. Differences between conventional and glyphosate tolerant soybeans and moisture effect in their discrimination by near infrared spectroscopy[J]. Food Chemistry,2013,141(3):1895-1901.

[24]Liu P F,He X Y,Chen D L,et al. A 90-day subchronic feeding study of genetically modified maize expressing Cry1Ac-M protein in Sprague-Dawley rats[J]. Food and Chemical Toxicology,2012,50(9):3215-3221.

[25]Zhu Y X,He X Y,Luo Y B,et al. A 90-day feeding study of glyphosate-tolerant maize with the G2-aroA gene in Sprague-Dawley rats[J]. Food and Chemical Toxicology,2013,51:280-287.

[26]He X Y,Tang M Z,Luo Y B,et al. A 90-day toxicology study of transgenic lysine-rich maize grain(Y642)in Sprague-Dawley rats[J]. Food and Chemical Toxicology,2009,47(2):425-432.

[27]陳金松,黃叢林,張秀海,等. 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)含有CaMV35S的轉(zhuǎn)基因玉米[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào),2011,26(4):8-14.

[28]閆興華,許文濤,商穎,等. 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米LY038[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2013,21(5):621-626.

[29]周杰,黃文勝,鄧婷婷,等. 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)6種轉(zhuǎn)基因大豆[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2017,25(2):335-344.

[30]張春梅,陳蘊(yùn)光,賴荷,等. 患兒雞蛋、牛奶過(guò)敏原體外檢測(cè)分析[J]. 標(biāo)記免疫分析與臨床,2009,16(3):153-155.

[31]Ross M P,Ferguson M,Street D,et al. Analysis of food allergic and anaphylactic events in the national electronic injury surveillance system[J]. Journal of Allergy Clinical Immunology,2008,121(1):166-171.

[32]Wal J M. Structure and function of milk allergens[J]. Allergy,2001,56(67):35-38.

[33]Mills E N,Valovirta E,Madsen C,et al. Information provision for allergic consumers-where are we going with food allergen labeling[J]. Allergy,2004,59(12):1262-1268.

[34]Bock S A,Munoz F A,Sampson H A. Fatalities due to anaphylactic reactions to foods[J]. Journal of Allergy Clinical Immunology,2000,107:191-193.

[35]鄒麗,李欣,佟平,等. 歐盟、澳大利亞和新西蘭食物過(guò)敏原標(biāo)識(shí)管理及對(duì)我國(guó)啟示[J]. 食品工業(yè)科技,2016,37(4):365-373.

[36]鄭穎,陳曙光,葉鈺,等. 日本食物過(guò)敏原的管理及對(duì)我國(guó)的啟示[J].食品科學(xué),2016,37(3):253-257.

[37]李欣,陳紅兵. 過(guò)敏原在食品加工中的變化[J]. 食品工業(yè),2005(1):50-52.

[38]王雪,汪何雅,錢和,等. 發(fā)酵法降低食品過(guò)敏性[J]. 食品科技,2011,36(6):302-304.

[39]孫佳益,王錫昌,劉源,等. 食物過(guò)敏原的低過(guò)敏性處理方法及其評(píng)價(jià)體系研究進(jìn)展[J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào),2012,31(4):495-501.

[40]Sharma S,Kumar P,Betzel C,et al. Structure and function of proteins involved in milk allergies[J]. Journal of Chromatography B,2001,756:183-187.

[41]Su M,Venkatachalam M,Teuber S S,et al. Impact ofγ-irradiation and thermal processing on the antigenicity of almond,cashew nut and walnut proteins[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture,2004,84(10):1119-1125.

[42]Byun M W,Lee J W,Yook H S,et al. Application ofγ-irradiation for inhibition of food allergy[J]. Radiation Physice Chemistry,2002,63:369-370.

[43]夏秀華. 食品加工技術(shù)對(duì)于食品過(guò)敏原的影響[J]. 糧食與食品工業(yè),2012,19(5):52-55.

[44]陳穎,王瑋. 食物過(guò)敏原檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J]. 檢驗(yàn)檢疫學(xué)刊,2011,21(3):4-7.

[45]鄭義成,華萍,楊安樹,等. 食物中過(guò)敏原檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué),2010,31(21):417-421.

[46]孫秀蘭,管露,單曉紅,等. 食品過(guò)敏原體外檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2012,43(2):126-132.

[47]顧可飛,李春紅,高美須,等. 食物過(guò)敏原及檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展[J]. 食品科技,2006,8:1-5.

[48]范安妮,佘之蘊(yùn),張施敬,等. 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)致敏小麥的研究[J]. 廣東化工,2016,43(2):31.

[49]宋濤平,楊麗霞,邱華麗,等. 動(dòng)物源性成分實(shí)時(shí)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法的建立[J]. 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào),2017,8(8):3207-3212.

[50]劉少寧,陳智,張志民,等. 鑒別綿羊肉中狐貍源性成分的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法的建立[J]. 中國(guó)食品衛(wèi)生雜志,2016,28(1):75-78.

[51]譚貴良,劉垚,李向麗,等. 食用植物油和地溝油中動(dòng)物源性成分LAMP檢測(cè)方法的建立[J]. 現(xiàn)代食品科技,2015,31(12):331-337.

[52]張國(guó)豪,黃國(guó)亮,郭素,等.一種微流控芯片及其應(yīng)用：中國(guó)，201210311357.2[P]. 2013-01-23.

[53]Wang D,Huo G,Wang F,et al. Drawback of loop-mediated isothermal amplification[J]. African Journal of Food and Science,2008(2):83-86.