施源德,楊 琴,黃迪惠,歐陽(yáng)銳,陳文韜,項(xiàng)雷文

(福建師范大學(xué)福清分校,食品軟塑包裝技術(shù)福建省高校工程研究中心,近海流域環(huán)境測(cè)控治理福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福清 350300)

我國(guó)是漁業(yè)養(yǎng)殖和捕撈大國(guó),據(jù)農(nóng)業(yè)部統(tǒng)計(jì)2016年魚(yú)類(lèi)產(chǎn)量高達(dá)4039萬(wàn)噸,魚(yú)肉產(chǎn)量和加工量大,生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的碎魚(yú)肉非常多。目前,碎魚(yú)肉多用做魚(yú)餌、魚(yú)飼料或丟棄,經(jīng)濟(jì)價(jià)值不高,還會(huì)造成環(huán)境污染,因此通過(guò)加工技術(shù)使低值魚(yú)肉高值化是食品加工研究熱點(diǎn)。

魚(yú)肉蛋白由肌原纖維蛋白、肌漿蛋白和肌基質(zhì)蛋白組成,而肌原纖維蛋白又由肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白以及原肌球蛋白與肌鈣蛋白所組成,其中肌球蛋白在一定條件下會(huì)從肌原纖維中溶解出來(lái),并可與魚(yú)肉中其他組分發(fā)生凝膠作用[1]。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者在魚(yú)肉蛋白凝膠作用方面的研究主要集中在食品類(lèi)粘合劑應(yīng)用[2],如轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(Transglutaminase,簡(jiǎn)寫(xiě)TG)[3]、蛋白類(lèi)添加物[4]、酪蛋白酸鈉(Sodium Caseinate,簡(jiǎn)寫(xiě)SC)[5]、多糖類(lèi)添加物[6-7]等,其中技術(shù)上比較成熟的有酶促交聯(lián)和糖基化交聯(lián)。酶促交聯(lián)是運(yùn)用酶制劑使蛋白質(zhì)之間發(fā)生共價(jià)交聯(lián)[8-9],糖基化交聯(lián)則利用還原糖對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行糖基化修飾[10]。在酶促交聯(lián)中,TG可催化蛋白質(zhì)酰基化反應(yīng)[11-12],即蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)TG催化后,蛋白質(zhì)分子間、分子內(nèi)通過(guò)共價(jià)鍵交聯(lián)在一起形成大分子物質(zhì),導(dǎo)致蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,質(zhì)構(gòu)特性隨之改變,同時(shí)一些輔料,如磷酸鹽、SC、NaCl等的復(fù)配使用可對(duì)魚(yú)肉產(chǎn)品保水性、硬度、凝膠強(qiáng)度有顯著影響[13-15]。

本文以TG-S、SC和NaCl復(fù)配蛋白交聯(lián)劑研究羅非魚(yú)碎肉重組工藝,以凝膠強(qiáng)度作為重組魚(yú)肉質(zhì)構(gòu)的分析指標(biāo),在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,用響應(yīng)面分析法優(yōu)化重組魚(yú)肉工藝來(lái)得到最優(yōu)的復(fù)配交聯(lián)劑配方和工藝操作方案,期望本研究能提高碎魚(yú)肉的利用率和附加值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅非魚(yú)(用來(lái)模擬碎魚(yú)肉) 市售;氯化鈉(食品級(jí)) 中鹽福建鹽業(yè)有限公司;酪蛋白酸鈉(食品級(jí)) 河南五星生物科技有限公司;丙烯酰胺、N′N(xiāo)-甲雙叉丙烯酰胺 上海麥克林生化科技有限公司;谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(TG-S,酶活力約50 U/mg) 江蘇省泰興市一鳴生物制品有限公司;十二烷基硫酸鈉、甘氨酸、三(羥甲基)氨基甲烷、乙酸、鹽酸、乙醇、四甲基乙二胺 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;考馬斯亮藍(lán) BBI生命科學(xué)有限公司;4×蛋白質(zhì)上樣緩沖液(含β-巰基乙醇) 北京索萊寶科技有限公司。

EZ-S型500N質(zhì)構(gòu)儀 日本島津;FW100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司;H-1850R型臺(tái)式高速離心機(jī) 湖南湘儀儀器有限公司;DYCZ-24DN型電泳槽 北京市六一儀器廠(chǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酶促交聯(lián)魚(yú)肉重組工藝流程 魚(yú)肉處理→解凍→拌機(jī)中空斬→添加NaCl斬拌→添加SC斬拌→加TG-S斬拌→入模定形→速凍→取出解凍,測(cè)定凝膠強(qiáng)度。

1.2.2 操作要點(diǎn)

1.2.2.1 魚(yú)肉處理 羅非魚(yú)肉去除皮、刺等雜質(zhì),冰水漂洗2～3次,吸干魚(yú)肉表面水分分裝速凍,備用。

1.2.2.2 解凍 羅非魚(yú)肉解凍后,吸干魚(yú)肉表面水分,稱(chēng)重取樣,斬拌機(jī)空斬5 min。

1.2.2.3 添加成分的處理及斬拌 NaCl、TG-S先用適量蒸餾水溶解,再加入肉中斬拌;SC直接加入斬拌。

1.2.2.4 入模定形 將斬拌后魚(yú)肉均勻分布于模具中,壓實(shí)。

1.2.2.5 速凍 5 ℃放置0.5 h后再放置于-18 ℃速凍24 h。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn) 為保持魚(yú)肉的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和風(fēng)味,所有實(shí)驗(yàn)均在低溫(5 ℃)下進(jìn)行。以凝膠強(qiáng)度作為產(chǎn)品評(píng)價(jià)指標(biāo),對(duì)TG-S、SC、NaCl的添加量和反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

反應(yīng)時(shí)間對(duì)重組魚(yú)肉凝膠強(qiáng)度的影響:在25 g魚(yú)肉中添加TG-S 0.9%、SC 1.1%、NaCl 1.0%,在5 ℃下反應(yīng)時(shí)間分別為0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 h,并在-18 ℃下速凍冷藏24 h后解凍至室溫,測(cè)定反應(yīng)時(shí)間對(duì)重組魚(yú)肉凝膠強(qiáng)度的影響。

TG-S添加量對(duì)重組魚(yú)肉凝膠強(qiáng)度的影響:在25 g魚(yú)肉中添加SC 1.1%、NaCl 1.0%,TG-S的添加量分別為0、0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%,在5 ℃下反應(yīng)0.5 h,并在-18 ℃下速凍冷藏24 h后解凍至室溫,測(cè)定TG-S添加量對(duì)重組魚(yú)肉凝膠強(qiáng)度的影響。

NaCl添加量對(duì)重組魚(yú)肉凝膠強(qiáng)度的影響:在25 g魚(yú)肉中添加SC 1.1%、TG-S 1.2%,NaCl添加量分別為0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%,在5 ℃下反應(yīng)0.5 h,在-18 ℃下速凍冷藏24 h后解凍至室溫,測(cè)定NaCl添加量對(duì)重組魚(yú)肉凝膠強(qiáng)度的影響。

SC添加量對(duì)重組魚(yú)肉凝膠強(qiáng)度的影響:在25 g魚(yú)肉中添加NaCl 2.0%、TG-S 1.2%,SC添加量分別為0、0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%,在5 ℃下反應(yīng)0.5 h,并在-18 ℃下速凍冷藏24 h后解凍至室溫,測(cè)定SC添加量對(duì)重組魚(yú)肉凝膠強(qiáng)度的影響。

1.2.3.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)法優(yōu)化工藝參數(shù) 以凝膠強(qiáng)度作為產(chǎn)品評(píng)價(jià)指標(biāo),運(yùn)用Box-Benhnken模型的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選擇3個(gè)對(duì)凝膠強(qiáng)度影響顯著的因素作為自變量,采用響應(yīng)面法分析并進(jìn)行重組工藝配方優(yōu)化,如表1所示。

表1 響應(yīng)面分析因素和水平表

1.2.4 凝膠強(qiáng)度測(cè)定的方法 用島津EZ-S型質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定重組魚(yú)肉的凝膠強(qiáng)度,凝膠強(qiáng)度=破斷強(qiáng)度(g)×凹陷深度(mm),單位g×mm。將重組魚(yú)肉解凍后進(jìn)行凝膠強(qiáng)度測(cè)定,測(cè)試采用食品檢測(cè)模式,實(shí)驗(yàn)類(lèi)型選擇壓縮,選擇的圓柱型探頭,測(cè)前、測(cè)中、測(cè)后速度分別為120、60、120 mm/min,測(cè)量距離10 mm,每組重復(fù)3次,取平均值作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果[16]。

1.2.5 蛋白質(zhì)分子凝膠電泳 純魚(yú)肉、重組魚(yú)肉制品取出解凍后稱(chēng)取0.5 g,加4 mL配制好的2%SDS溶液提取蛋白,60 ℃水浴鍋加熱30 min,10000 r/min冷凍離心5 min,取上清液0.5 mL,用2%SDS提取液稀釋1倍后移取120 μL,加入40 μL的4×上樣液,95 ℃加熱5 min,3000 r/min離心2 min,取適量上清液進(jìn)行電泳。

分離膠選用7.5%,濃縮膠選用4.5%;濃縮膠階段電壓80 V,分離膠階段電壓120 V;電泳結(jié)束后,用考馬斯亮藍(lán)液避光染色1 h,而后用蒸餾水清洗,再用脫色液脫色,取出膠片掃描[17-18]。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin9、Design-Expert軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)及分析

2.1.1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)重組魚(yú)肉凝膠強(qiáng)度的影響 由圖1可知,5 ℃下反應(yīng)隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),凝膠強(qiáng)度呈現(xiàn)先增大后減小再增大的趨勢(shì),反應(yīng)0.5 h時(shí)的凝膠強(qiáng)度最大。出現(xiàn)這種趨勢(shì)的原因可能是:隨著反應(yīng)時(shí)間的進(jìn)行,蛋白質(zhì)交聯(lián)作用和凝膠三維結(jié)構(gòu)的松弛的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系導(dǎo)致的[19],即首先SC對(duì)蛋白質(zhì)的交聯(lián)起主導(dǎo)作用導(dǎo)致凝膠強(qiáng)度先增大,緊接著凝膠三維結(jié)構(gòu)松弛導(dǎo)致凝膠強(qiáng)度減小;而后TG-S酶對(duì)蛋白質(zhì)的交聯(lián)起主導(dǎo)作用導(dǎo)致凝膠強(qiáng)度再增大,因此選擇反應(yīng)時(shí)間為0.5 h。

圖1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)重組魚(yú)肉凝膠強(qiáng)度的影響

2.1.2 TG-S添加量對(duì)重組魚(yú)肉凝膠強(qiáng)度的影響 圖2可知,隨著酶添加量的增加,重組魚(yú)肉的凝膠強(qiáng)度增大,說(shuō)明TG-S可使魚(yú)肉中的鹽溶性蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)。當(dāng)酶添加到1.2%時(shí)凝膠強(qiáng)度達(dá)到較高值,之后隨著酶添加量增大,凝膠強(qiáng)度值增加趨于平緩,這可能是因?yàn)榭捎糜诿复俳宦?lián)的底物蛋白質(zhì)已基本耗盡,所以繼續(xù)增加酶的量也無(wú)法使凝膠強(qiáng)度增大[20]。因此選擇TG-S添加量為0.9%、1.2%、1.5%范圍內(nèi)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

圖2 TG-S添加量對(duì)重組魚(yú)肉凝膠強(qiáng)度的影響

2.1.3 NaCl添加量對(duì)重組魚(yú)肉凝膠強(qiáng)度的影響 圖3所示,隨著NaCl添加量的增加,重組魚(yú)肉的凝膠強(qiáng)度先下降再增加,這可能是因?yàn)閯傞_(kāi)始加入的NaCl使已經(jīng)溶出的鹽溶性蛋白質(zhì)發(fā)生變性[21],蛋白質(zhì)間交聯(lián)減少,凝膠強(qiáng)度減小;但隨著NaCl增加到一定值時(shí),肌原纖維細(xì)胞中的鹽溶性蛋白大量溶出,使TG-S和SC可作用的底物蛋白增多,凝膠強(qiáng)度增大。在NaCl添加量為2.0%后達(dá)到高峰段,因此選擇添加量為2.0%、2.2%、2.4%進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

圖3 NaCl添加量對(duì)重組魚(yú)肉凝膠強(qiáng)度的影響

2.1.4 SC添加量對(duì)重組魚(yú)肉凝膠強(qiáng)度的影響 圖4可知,SC加入量在0～1.2%時(shí),凝膠強(qiáng)度值隨著SC加入量的增加緩慢上升,這說(shuō)明SC可使重組制品凝膠強(qiáng)度增大。SC添加量超過(guò)1.2%之后凝膠強(qiáng)度值反而下降,表明過(guò)多的SC并不會(huì)提高重組制品的凝膠強(qiáng)度,這與Kuraishi等研究結(jié)論是相吻合的[22],即可能過(guò)多SC會(huì)在魚(yú)肉制品中形成小的凝膠囊泡,削弱凝膠結(jié)構(gòu),使凝膠強(qiáng)度下降。因此選擇SC添加量為0.9%、1.2%、1.5%進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

圖4 SC添加量對(duì)重組魚(yú)肉凝膠強(qiáng)度的影響

2.2 響應(yīng)面分析法工藝參數(shù)優(yōu)化

2.2.1 多元二次響應(yīng)面回歸模型的建立及顯著性檢驗(yàn) 利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)做處理和分析,從中得到了各因子對(duì)響應(yīng)值的二次多項(xiàng)回歸模型為:

表2 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

Y=-164.70+193.37A+56.37B-45.57C-4.86AB+20.71AC-7.037BC-47.30A2-16.27B2+3.44C2

對(duì)所得的回歸方程進(jìn)行有效性檢驗(yàn),可知各個(gè)因素對(duì)重組產(chǎn)品凝膠強(qiáng)度影響。各因素對(duì)重組魚(yú)肉凝膠強(qiáng)度的影響回歸方程方差分析見(jiàn)表3。

由表3可知,該模型的p=0.0019<0.01,表明模型回歸效果極其顯著。模型相關(guān)系數(shù)R2=0.9742,CV=0.79,失擬項(xiàng)p=0.1851>0.05,表明差異不顯著,模型和實(shí)驗(yàn)的擬合程度良好,因此響應(yīng)面分析法所得二次方程模型可信,能夠用來(lái)指導(dǎo)酶促交聯(lián)魚(yú)肉重組工藝優(yōu)化。

表3 回歸方程方差分析表

二次多項(xiàng)回歸方程中的一次項(xiàng)P(A)=0.0018<0.01,P(B)=0.0015<0.01,P(A)=0.0278<0.05,證明NaCl、SC、TG-S對(duì)凝膠強(qiáng)度效果影響顯著,其中添加NaCl、SC添加量對(duì)凝膠強(qiáng)度效果影響極顯著。在交互項(xiàng)中,P(AC)=0.0025<0.01,說(shuō)明NaCl與SC交互作用對(duì)凝膠強(qiáng)度影響極顯著;P(BC)=0.0357<0.05,TG-S與SC交互作用對(duì)凝膠強(qiáng)度效果影響顯著;P(AB)=0.2456>0.05,所以NaCl與TG-S交互作用對(duì)凝膠強(qiáng)度效果影響不顯著;二次項(xiàng)A2、B2對(duì)凝膠強(qiáng)度的影響均極顯著(p<0.01),C2影響不顯著(p>0.05),這說(shuō)明各因素交互作用對(duì)于響應(yīng)值有影響,而不是簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系。

2.2.2 響應(yīng)面曲面圖分析 圖5～圖7客觀(guān)反映了各因素之間的交互作用對(duì)重組魚(yú)肉凝膠強(qiáng)度的影響,從圖形的陡峭形態(tài)可知,NaCl與SC添加量之間、SC與TG-S酶添加量之間的交互作用明顯;而TG-S酶與NaCl添加量之間交互作用不明顯,與表3結(jié)論基本一致。

圖5 NaCl與TG-S添加量對(duì)重組魚(yú)肉凝膠強(qiáng)度的影響

圖6 NaCl與SC添加量對(duì)重組魚(yú)肉凝膠強(qiáng)度的影響

圖7 TG-S與SC添加量對(duì)重組魚(yú)肉凝膠強(qiáng)度的影響

2.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 由Design-Expert軟件的響應(yīng)面分析可得到酶促交聯(lián)魚(yú)肉重組最佳條件為:NaCl為2.32%、TG-S為1.06%、SC為1.50%、反應(yīng)時(shí)間0.5 h,在此條件下重組魚(yú)肉制品凝膠強(qiáng)度理論預(yù)測(cè)值為3493.5 g×mm 。然后根據(jù)實(shí)際情況修正為NaCl為2.3%，TG-S為1.1%，SC為1.5%反應(yīng)時(shí)間0.5 h，在此條件測(cè)得的凝膠強(qiáng)度的值3409.5 g×mm,與理論預(yù)測(cè)值相近。

2.3 蛋白質(zhì)分子凝膠電泳結(jié)果分析

重組魚(yú)肉、新鮮魚(yú)肉和標(biāo)準(zhǔn)蛋白的SDS-PAGE結(jié)果,如圖8。

圖8 重組魚(yú)肉凝膠SDS-PAGE圖譜

從圖8可知,在相對(duì)分子質(zhì)量為200和40 KDa的蛋白質(zhì)電泳條帶強(qiáng)度減少明顯,該結(jié)論與張?jiān)骑w的研究相似[18],即說(shuō)明復(fù)配的交聯(lián)劑催化的作用部位主要是肌球蛋白重鏈,而分子量為40 KDa條帶也減弱,這可能是NaCl使鹽析蛋白從肌肉中溶出,并在TG-S作用下與其他蛋白質(zhì)發(fā)生聚合,另外,重組魚(yú)肉制品電泳條帶中肌動(dòng)蛋白(Actin)、原肌球蛋白(Tm)的條帶并未發(fā)生明顯變化,說(shuō)明它們并未參與TG-S的交聯(lián)作用。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定最佳反應(yīng)時(shí)間為0.5 h,并以NaCl、TG-S、SC添加量這3個(gè)重要因素為自變量,以凝膠強(qiáng)度為指標(biāo),通過(guò)響應(yīng)面分析法進(jìn)行酶促交聯(lián)魚(yú)肉重組工藝優(yōu)化,分析結(jié)果表明響應(yīng)面多元二次回歸模型極顯著,不是簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系。酶促交聯(lián)魚(yú)肉重組最佳工藝條件為:NaCl為2.3%、TG-S為1.1%、SC為1.5%、反應(yīng)時(shí)間0.5 h,在此條件下重組魚(yú)肉制品凝膠強(qiáng)度3409.5 g×mm,與理論預(yù)測(cè)值為3493.5 g×mm相近,且重組后的魚(yú)碎肉的凝膠強(qiáng)度提高了1.6倍。通過(guò)SDS-PAGE,可知復(fù)配的交聯(lián)劑催化的作用部位主要是相對(duì)分子質(zhì)量為200和40 KDa蛋白質(zhì)分子。

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