針對(duì)急性心肌梗死病人,實(shí)施及早、有效的再灌注治療如溶栓或者經(jīng)皮冠脈介入,是減少梗死面積、改善臨床預(yù)后的治療措施[1]。然而,恢復(fù)血流的同時(shí)有可能帶來(lái)局部細(xì)胞凋亡、炎癥或者氧化負(fù)荷,導(dǎo)致不可逆細(xì)胞損傷,這種現(xiàn)象即心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI)。MIRI可引起心臟功能不全包括心律失常、微血管損傷和細(xì)胞死亡。損傷機(jī)制包括大量活性氧(ROS)激活、鈣超載、促炎性因子釋放、凋亡發(fā)生、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、內(nèi)皮細(xì)胞功能不全[2-3]。如何減輕和避免MIRI成為再灌注治療的重要內(nèi)容。大量實(shí)驗(yàn)表明,遠(yuǎn)端缺血預(yù)適應(yīng)(remote ischemic percondition-ing,RIPerC)[4]和缺血后適應(yīng)(remote ischemic postconditioning,RIPostC)[5]干預(yù)措施能夠減輕缺血再灌注損傷。

最近研究把晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products,RAGE)放在介導(dǎo)MIRI的信號(hào)通路的中心位置。RAGE是一種多配體的膜受體,可表達(dá)于大多數(shù)組織和一系列細(xì)胞中,在炎癥發(fā)展過(guò)程中起到重要作用,與配體高遷移率族蛋白B1(high-mobility group box 1,HMGB1)、晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGEs)、β 淀粉樣蛋白(β-amyloid,Aβ) 等結(jié)合后,可啟動(dòng)多條信號(hào)通路,引起細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng),細(xì)胞功能紊亂,導(dǎo)致糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、MIRI等疾病的發(fā)生[6]。FPS-ZM1(FZM1)是RAGE的特異性阻斷劑[7-8],本文將著重探究FZM1在小鼠MIRI模型中的具體作用及其信號(hào)通路。

1 材料與方法

1.1 材料 7～9周齡健康雄性C57BL/B6小鼠(南京青龍山動(dòng)物中心)32只,體質(zhì)量20～25 g,無(wú)特定病原體(specific pathogen free, SPF)級(jí)。使用儀器和試劑:小鼠呼吸機(jī),小鼠心超儀(Vevo770 imaging system,加拿大),顯微手術(shù)器械,自制小鼠氣管插管,伊文氏藍(lán)(Evans blue,Sigma公司,美國(guó)),BCA蛋白定量,試劑盒(碧云天公司,上海),抗RAGE、HMGB1、P-ERK1/2(cell signaling公司,美國(guó)),抗ERK1/2抗體、GAPDH抗體(Bioworld 公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠心肌缺血再灌注模型的建立:小鼠腹腔內(nèi)注射1%戊巴比妥,通過(guò)自制小鼠氣管導(dǎo)管成功連接小鼠呼吸機(jī)(呼吸頻率90～100次/min),核心體溫保持在37 ℃左右。在第3、4肋間開(kāi)胸,暴露出左心耳及左心室,在左心耳下緣2 mm處用7-0的帶線(xiàn)縫合針橫穿于冠狀動(dòng)脈前降支并結(jié)扎(打一活結(jié)),觀(guān)察左心室前壁顏色由紅色逐漸變白色并且室壁運(yùn)動(dòng)減弱表明結(jié)扎成功,45 min之后打開(kāi)活結(jié)實(shí)現(xiàn)缺血后的再灌注,封胸。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組與干預(yù):小鼠隨機(jī)分為4組,即假手術(shù)組(sham組,連續(xù)腹腔注射1周生理鹽術(shù),開(kāi)胸,不結(jié)扎),FPS-ZM1對(duì)照組(FZM1組,連續(xù)腹腔注射1周1 mg/kg FPS-ZM1,開(kāi)胸,不結(jié)扎),缺血再灌注組(I/R組,腹腔注射生理鹽水,結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈45 min),FPS-ZM1干預(yù)組(FZM1+I/R組,手術(shù)前腹腔注射FPS-ZM1,結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈45 min)。

1.2.3 血流動(dòng)力學(xué)測(cè)定:再灌注1周后,小鼠給予1%戊巴比妥鈉,通過(guò)M型超聲(Vevo770 imaging system,加拿大)測(cè)定左室射血分?jǐn)?shù)(left venricular ejection fraction,LVEF)、左室縮短分?jǐn)?shù)(left venricular fractional shortening,LVFS)。

1.2.4 蘇木精-伊紅(HE)染色：小鼠超聲檢測(cè)后，取出心臟組織放入4%的甲醛溶液中24 h，使用切片機(jī)切取5 μm左右的組織, HE染色后在光鏡下觀(guān)察心肌超微結(jié)構(gòu)變化。

1.2.5 Western blot:再灌注24 h后取出心臟,加入組織裂解液,用BCA蛋白定量試劑盒(碧云天)測(cè)定總蛋白,加入一定比例的蛋白上樣緩沖液100 ℃煮5 min, 取30 μg蛋白進(jìn)行10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,5%脫脂牛奶封閉2 h,分別加入GAPDH(1∶10000),抗RAGE(1∶1000),抗HMGB1(1∶1000),抗P-ERK(1∶1000),抗ERK(1∶500),4 ℃過(guò)夜,洗膜3次,每次10 min,加入含有辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶10000),室溫2 h,洗膜,最后ECL,孵育,曝光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的變化 與sham組和FZM1組相比,I/R組小鼠心臟收縮功能指標(biāo)(LVEF、LVFS)明顯降低；與I/R組相比,FZM1+I/R組LVEF及LVFS均有所上升,說(shuō)明FZM1能使MIRI小鼠的心臟收縮功能得到一定恢復(fù)(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠LVEF、LVFS比較%,n=8)

注: 與 sham組比較,*P<0.05;與I/R 組比較,△P<0.05;與FIM1組比較，#P<0.05

2.2 HE染色 與sham組相比,I/R 心肌纖維結(jié)構(gòu)排列紊亂,發(fā)生細(xì)胞壞死,炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯,與I/R組相比,FZM1+I/R組的心肌壞死灶面積有一定縮小,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少。見(jiàn)圖1。

圖1 各組心臟組織的鏡下超微結(jié)構(gòu)

2.3 蛋白表達(dá)比較 與sham組相比,I/R組RAGE及HMGB1表達(dá)量升高(P<0.05);與I/R組相比,FZM1+I/R組RAGE及HGMB1表達(dá)量顯著減少(P<0.05),而P-ERK/ERK表達(dá)量顯著上升(P<0.01)。見(jiàn)圖2，3。

圖2 各組蛋白表達(dá)的Western blot

3 討論

再灌注治療,尤其是溶栓和抗血小板治療能夠顯著改善急性心肌梗死病人的臨床預(yù)后,然而再灌注治療之前的缺血損害[9],可以觸發(fā)ROS系統(tǒng)的激活,導(dǎo)致心肌細(xì)胞的功能障礙,細(xì)胞死亡及炎癥反應(yīng)[10]。最近幾年，不少學(xué)者已經(jīng)關(guān)注于研制出有效的藥物干預(yù)措施去加強(qiáng)缺血再灌注損傷的心肌耐受程度。

注:與 sham組比較,*P<0.05; 與I/R 組比較, △P<0.05圖3 心肌組織RAGE、HMGB1、P-ERK/ERK蛋白表達(dá)變化

之前研究已經(jīng)指出，RAGE及其配體已經(jīng)參與到MIRI, AGEs和其他的促炎性因子以及組織損傷性配體與RAGE結(jié)合后,能夠激活許多重要的下游通路。部分研究報(bào)道可溶性晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(soluble advanced glycation end products,sRAGE)干預(yù)或者基因敲除RAGE之后,能夠保護(hù)再灌注心臟面免受損傷和功能不全,改善心臟功能和代謝[9]。本研究通過(guò)藥物FZM1干預(yù)缺血再灌注小鼠成功阻斷RAGE(可能是FZM1直接成功阻斷RAGE表達(dá)),小鼠心臟的HE染色結(jié)果顯示,心肌細(xì)胞發(fā)生炎癥、壞死、水腫的程度明顯減輕,心臟LVEF由(48.23±0.74)%升高到(52.59±1.05)%,LVFS由(23.74±0.29)%升高到(26.37±0.29)%。

HMGB1是一種非染色體核蛋白,參與穩(wěn)定核小體和調(diào)控基因表達(dá),能夠從激活的免疫細(xì)胞中主動(dòng)釋放出來(lái),或者從壞死和凋亡細(xì)胞中被動(dòng)釋放出[11]。研究證實(shí)，細(xì)胞外的HMGB1是一種潛在的促炎性因子,能夠促進(jìn)中性粒細(xì)胞聚集并激活單核細(xì)胞釋放更多的炎性因子,在MIRI中有助于放大炎性反應(yīng)[12-14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示I/R組的HMGB1蛋白表達(dá)量較sham組明顯增加,且HE圖片上顯示I/R組心肌發(fā)生明顯炎癥,說(shuō)明手術(shù)干預(yù)使心肌細(xì)胞發(fā)生了壞死或者凋亡等應(yīng)激之后,釋放了許多促炎性因子，促使心肌組織發(fā)生炎癥反應(yīng),而HMGB1引導(dǎo)的炎癥反應(yīng)主要是通過(guò)激活RAGE來(lái)實(shí)現(xiàn)的[15]。在慢性間歇缺氧(chronic intermittent hypoxia,CIH)動(dòng)物模型中,HMGB1可能是sRAGE的主要作用靶點(diǎn),腹腔注射sRAGE(相當(dāng)于阻斷RAGE表達(dá))能在一定程度上降低由CIH引起的RAGE及HMGB1釋放量,sRAGE可能是通過(guò)下調(diào)HMGB1發(fā)揮抗炎作用的[16]。根據(jù)以上研究結(jié)果,本實(shí)驗(yàn)Western blot結(jié)果可解釋為兩方面原因:其一,FZM1(阻斷RAGE)干預(yù)可以直接下調(diào)由I/R引起的HMGB1蛋白表達(dá)而發(fā)揮保護(hù)作用。其二,根據(jù)HE染色結(jié)果,可判斷出FZM1能夠降低由I/R導(dǎo)致的發(fā)生壞死或者凋亡的心肌細(xì)胞數(shù)目比例,進(jìn)而減少由心臟組織中壞死細(xì)胞釋放的HMGB1總量。另有報(bào)道稱(chēng)在缺血性心臟病中,血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitors,ACEI)或者血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑能夠上調(diào)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶-2(angiotensin converting enzyme-2,ACE2)的水平,通過(guò)阻斷HMGB1下游炎癥信號(hào)的傳遞起到心臟保護(hù)作用,能夠使心臟收縮功能指標(biāo)LVEF值提高21%[17]。本研究中FZM1對(duì)缺血再灌注的保護(hù)作用可能就是通過(guò)阻斷HMGB1-RAGE信號(hào)軸來(lái)抑制HMGB1下游信號(hào)的傳遞,而使得心臟收縮功能增強(qiáng)。HMGB1可以通過(guò)與其特異性受體包括RAGE、toll樣受體-2(toll-like receptor-2,TLR-2)、TLR-4結(jié)合發(fā)揮促炎作用[18],配體與受體的結(jié)合能夠激活核轉(zhuǎn)錄因子(NF-kB)釋放,或者通過(guò)影響絲 裂 原 活 化 蛋 白 激 酶 (mitogen activated protein kinase, MAPK) 信號(hào)[19],最終導(dǎo)致大量炎性因子的表達(dá)增加和釋放。由此可見(jiàn),HMGB1與RAGE信號(hào)軸是一條重要的炎性信號(hào)通路,可以介導(dǎo)MIRI的發(fā)生發(fā)展。MAPK是蛋白酶超家族,由細(xì)胞外信號(hào)調(diào)控酶和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal regulated protein kinase, ERK1/2) 、c-Jun N-末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、p38 組成。MAPK中的p38和JNK能夠引起炎癥、細(xì)胞凋亡[20],而ERK1/2的作用比較復(fù)雜,有文獻(xiàn)報(bào)道長(zhǎng)時(shí)間的MIRI,ERK1/2以介導(dǎo)損傷細(xì)胞為主,而在早期的損傷中,ERK參與細(xì)胞的內(nèi)源性保護(hù),ERK信號(hào)是RAGE下游通路的部分組成成分[21]。在哮喘疾病模型中,已經(jīng)證實(shí)HMGB1可以通過(guò)激活RAGE及其下游信號(hào)ERK1/2起到損傷呼吸道上皮屏障功能的作用。而本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，F(xiàn)ZM1+I/R組的P-ERK水平明顯比I/R組高(總的ERK在各組之間無(wú)明顯差異),可推斷出阻斷HMGB1與RAGE的結(jié)合會(huì)進(jìn)一步激活其下游信號(hào)成分ERK1/2,從而起到保護(hù)MIRI的作用。不少文獻(xiàn)報(bào)道藥物干預(yù)間接激活ERK1/2后,可有效減輕心肌梗死[22],由此根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可解釋為:小鼠MIRI給予FZM1干預(yù)后,先抑制了HMGB1與RAGE信號(hào)傳導(dǎo)軸,后激活二者的下游信號(hào)分子ERK1/2。

綜上所述,藥物FPS-ZM1可以通過(guò)阻斷HMGB1-RAGE 信號(hào)軸,激活其下游信號(hào)是MAPK/ERK成分,減輕由MIRI導(dǎo)致的心肌壞死、水腫及炎癥的程度,并且能改善心臟收縮功能。以上結(jié)果表明,RAGE很可能成為臨床上預(yù)防MIRI的一個(gè)潛在治療靶點(diǎn)。

[]

[1] Aleshin A, Ananthakrishnan R, Li Q,et al.RAGE modulates myocardial injury consequent to LAD infarction via impact on JNK and STAT signaling in a mu-rine mode[J].AM J Physiol Heart Circ Physiol,2008,294(4):1823-1832.

[2] Hao M, Zhu S, Hu L,et al.Myocardial ischemic postconditioning promotes au-tophagy against ischemia reperfusion injury via the activation of the nNOS/AMPK/mTOR pathway[J].Int J Mol Sci, 2017,18(3): pii: E614.

[3] Jennings RB.Historical perspective on the pathology of myocardial ischemia/reperfusion injury[J].Circ Res, 2013,113(4):428-438.

[4] Zhang J, Zhang J, Yu P,et al.Remote ischaemic preconditioning and sevoflu-rane postconditioning synergistically protect rats from myocardial injury induced by ischemia and reperfusion partly via inhibition TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway[J].Cell Physiol Biochem, 2017,41(1):22-32.

[5] Zhu J, Yao K, Wang Q,et al.Ischemic postconditioning-regulated miR-499 protects the rat heart against ischemia/reperfusion injury by inhibiting apoptosis through PDCD4[J].Cell Physiol Biochem,2016,39(6):2364-2380.

[6] Tekabe Y, Luma J, Li Q,et al.Imaging of receptors for advanced glycation end products in experimental myocardial ischemiaand reperfusion injury[J]. JACC Cardiovasc Imaging, 2012,5(1):59-67.

[7] Deane R, Singh I, Sagare AP,et al.A multimodal RAGE-specific inhibitor reduces amyloid β-mediated brain disorder in a mouse model of Alzheimer disease [J].J Clin Invest,2012,122(4):1377-1392.

[8] Hong Y, Shen C, Yin Q,et al.Effects of RAGE-specific inhibitor FPS-ZM1 on amyloid-β metabolism and ages-induced inflammation and oxidative stress in rat hippocampus[J].Neurochem Res,2016,41(5):1192-1199.

[9] Bucciarelli LG, Kaneko M, Ananthakrishnan R,et al.Receptor for advanced-glycation end products: key modulator of myocardial ischemic injury[J].Circulation,2006,113(9):1226-1234.

[10] Jordan JE, Zhao ZQ, Vinten-Johansen J.The role of neutrophils in myocardial ischemia-reperfusion injury[J].Cardiovasc Res,1999,43(4):860-878.

[11] Hu G, Zhang Y, Jiang H,et al.Exendin-4 attenuates myocardial ischemia and reperfusion injury by inhibiting high mobility group box 1 protein expression[J].Cardiol J,2013,20(6):600-604.

[12] Andersson U, Wang H, Palmblad K, et al.High mobility group 1 protein (HMG-1) stimulates proinflammatory cytokine synthesis in human monocytes[J].J Exp Med, 2000,192(4):565-570.

[13] Herzog C, Lorenz A, Gillmann HJ,et al.Thrombomodulin’s lectin-like domain reduces myocardial damage by interfering with HMGB1-mediated TLR2 signalling[J].Cardiovasc Res,2014,101(3):400-410.

[14] Ding HS, Yang J, Gong FL,et al.High mobility group box 1 mediates neutrophil recruitment in myocardial ischemia—reperfusion injury through toll like receptor 4-related pathway[J].Gene,2012,509(1):149-153.

[15] Nogueira-Machado JA, de Oliveira Volpe CM.HMGB-1 as a target for inflammation controlling[J].Recent Pat Endocr Metab Immune Drug Discov,2012,6(3):201-209.

[16] Wu X, Gu W, Lu H, et al.Soluble receptor for advanced glycation end product ameliorates chronic intermittent hypoxia induced renal injury, inflammation and apoptosis via P38/JNK signaling pathways[J].Oxid Med Cell Longev, 2016:1015390. Epub 2016 Sep 5.

[17] Li JZ,Xie MQ,Mo D,et al.Picroside Ⅱ protects myocardium from ischemia/reperfusion-induced injury through inhibition of the inflammatory response [J].Exp Ther Med,2016,12(6):3507-3514.

[18] Li JZ, Wu JH, Yu SY,et al.Inhibitory effects of paeoniflorin on lysophosphatidylcholine induced inflammatory factor production in human umbilical vein endothelial cells[J].Int J Mol Med, 2013,31(2):493-497.

[19] Villarreal A, Aviles Reyes RX, Angelo MF,et al.S100B alters neuronal survival and dendrite extension via RAGE-mediated NF-κB signaling[J].J Neurochem,2011,117(2):321-32.

[20] Shimada K, Nakamura MIshida E.Roles of p38-and c-jun NH2-terminal kinase mediated pathways in 2-methoxyestradiol-induced p53 induction and apoptosis [J].Carcinogenesis, 2003,24(6):1067-1075.

[21] Muth IE, Zschüntzsch J, Kleinschnitz K,et al.HMGB1 and RAGE in skeletal muscle inflammation: Implications for protein accumulation in inclusion body myositis [J].Exp Neurol,2015,271:189-197.

[22] Bourke L, McCormick J, Taylor V, et al.Hydroxychloroquine protects against cardiac ischaemia/reperfusion injury in vivo via ehancement of ERK1/2 phosphorylation[J].PLoS One, 2015,10(12):e0143771.