何驚春，凌 華，張 敏，王 越，吳國輝，盧戎戎，周全華△（.九龍坡區(qū)疾病預(yù)防控制中心，重慶400039；.重慶市疾病預(yù)防控制中心，重慶40004）

男男性接觸（MSM）者由于其多性伴、性伴更換頻率高、不安全性行為等因素，成為人類免疫缺陷病毒（HIV）感染的危險人群。1981年美國洛杉磯和紐約首次報道的獲得性免疫缺乏綜合征（AIDS）患者便是

MSM[1]。西歐和北美的研究顯示，MSM人群是HIV耐藥發(fā)生的主要高危人群之一[2]。由于我國MSM人群具有安全套使用率低、多性伴和雙性戀比例高等特點[3-4]，使我國MSM人群成為HIV向普通人群傳播的橋梁。MSM

人群中耐藥株的流行情況可以從一定程度上反映新發(fā)

HIV感染者中耐藥株的傳播情況。本研究對重慶市門診調(diào)查新發(fā)現(xiàn)的148例感染者治療前的血樣進(jìn)行基因型耐藥研究，分析該人群耐藥的流行情況。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年1月至2015年12月重慶市疾病預(yù)防控制中心性病門診調(diào)查新發(fā)現(xiàn)、經(jīng)流行病調(diào)查其傳播途徑為MSM、經(jīng)AIDS確證實驗室蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）試驗確證為HIV-1陽性的148例感染者。年齡 16～62歲，平均（28.65±8.34）歲。采集患者的外周血置于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中，立即混勻，于6 h內(nèi)常規(guī)離心機抗凝血分離血漿，分裝后-80℃凍存，用于耐藥基因型檢測。

1.2 方法

1.2.1 病毒基因組RNA提取 參照QIAGEN公司Viral RNA Extraction Kit操作。

1.2.2 In-house方法擴增蛋白酶編碼區(qū)及逆轉(zhuǎn)錄酶編碼區(qū) 參照全國HIV耐藥監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)和檢測技術(shù)制訂的標(biāo)準(zhǔn)操作程序操作，用In-honse方法擴增HIV-1蛋白酶基因區(qū)（pol區(qū)）全序列與部分逆轉(zhuǎn)錄酶序列，引物均由TAKARA生物工程有限公司合成，引物見表1。第1輪聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）引物為MAW-26、RT-21，體系試劑使用TAKARA公司生產(chǎn)的PrimeScriptTMOne Step RTPCR Kit Ver.2（Dye Plus）。反應(yīng)條件為：50 ℃ 30 min；94℃ 2 min；94℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 1.2 min 30個循環(huán)；72℃10 min；4℃保溫。第2輪PCR引物為PRO-1、RT-20，體系試劑使用Promega生物有限公司生產(chǎn)的GoTaq Hot Start Polymerase。反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 2.5 min；4℃保溫。

表1 引物名稱、序列、位置

1.2.3 目的片段的回收、純化及基因測序 采用RTPCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳觀察確定相對分子質(zhì)量后，將產(chǎn)物送諾賽基因有限公司純化并測序。

1.2.4 耐藥基因分析 所得的序列用Chromas2.6軟件進(jìn)行編輯校正后，序列上傳至https：//hivdb.stanford.edu/網(wǎng)址，利用HIV db系統(tǒng)進(jìn)行耐藥性分析，獲得樣本對各類藥物耐藥的最終解釋。

2 結(jié) 果

2.1 亞型情況 對蛋白酶和逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析結(jié)果顯示，76.35%（113/148）為CRF07-BC亞型重組，19.59%（29/148）為CRF01-AE亞型重組，2.03%（3/148）為 B 亞型，2.03%（3/148）為 CRF55-01B 亞型重組。

2.2 蛋白酶抑制劑相關(guān)耐藥變異情況 148例標(biāo)本中檢出3例原發(fā)性突變，其中1例CRF01-AE重組亞型毒株攜帶M46L原發(fā)性變異，該變異造成對阿扎那韋（ATV/r）、呋山那韋（FPV/r）、茚地那韋（IDV/r）、克力芝（LPV/r）、沙奎那韋（SQV/r）、替拉那韋（TPV/r）潛在耐藥，1例CRF07-BC重組亞型毒株發(fā)生K20T原發(fā)性突變，1例CRF07-BC重組亞型毒株發(fā)生Q58E原發(fā)性突變，這2例突變未造成對蛋白酶類藥物的耐藥。

2.3 逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑相關(guān)耐藥變異 148例標(biāo)本中14例標(biāo)本出現(xiàn)非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（NNRTIs）相關(guān)耐藥突變，發(fā)生在 V179（12/14）、E138（1/14）和 G190（1/14），其中1例CRF01-AE重組亞型發(fā)生V179VD原發(fā)性變異，該變異造成對依非韋倫（EFV）、奈韋拉平（NVP）的中度耐藥，1例B亞型發(fā)生G190A原發(fā)性變異，該變異造成對NVP高度耐藥，對EFV中度耐藥。其他12例標(biāo)本的原發(fā)性耐藥均造成EFV、ETR、NVP、RPV的潛在耐藥。

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，存在 CRF07-BC、CRF01-AE、B、CRF55-01B等4種亞型，所占比例分別為76.35%、19.59%、2.03%和2.03%。這與深圳市[5]、北京市調(diào)查的CRF01-AE為主的亞型分布不一致[6]，但和貴州省[7]、四川省調(diào)查的亞型分布趨勢極為相似[8]。分析這一結(jié)果，可能與MSM人群流動性、人群本身特性、HIV傳入MSM人群的方式有關(guān)。

HIV/AIDS患者出現(xiàn)耐藥性主要來自2種途徑，一種是感染了耐藥毒株（即原發(fā)性耐藥），另一種是敏感株在藥物的壓力下向突變產(chǎn)生的耐藥株（即繼發(fā)性耐藥）轉(zhuǎn)變[9]。高效抗病毒治療（HAART）能夠抑制HIV-1病毒的復(fù)制，延長患者生命，提高其生命質(zhì)量，降低病死率，但如果患者依從性不好，導(dǎo)致病毒未能完全抑制，則有可能產(chǎn)生繼發(fā)性耐藥毒株，而耐藥株的大量復(fù)制是導(dǎo)致抗病毒治療失敗的主要原因之一。資料顯示，原發(fā)性耐藥毒株出現(xiàn)在新發(fā)感染者中證明了耐藥株的傳播。歐美等發(fā)達(dá)國家10%以上的新發(fā)HIV感染者至少對1種抗病毒治療藥物耐藥[10-11]。然而，與其他人群比較，MSM人群中的原發(fā)耐藥發(fā)生率更高[12]。若采用世界衛(wèi)生組織的耐藥監(jiān)測突變列表，且不考慮次要突變，MSM人群中阿根廷原發(fā)耐藥發(fā)生率為7.7%（2006—2008年）[13]，以色列原發(fā)耐藥發(fā)生率為29%[12]，我國天津市、貴州省和四川省、深圳市等省市原發(fā)耐藥突變率分別為 20.0%[14]、22.4%[7]、25.9%[8]、22.5%[15]。本研究中，重慶市MSM人群原發(fā)耐藥突變率為11.5%（17/148），低于上述省市，但仍處于中度流行水平。

MSM新發(fā)感染人群中，耐藥突變發(fā)生率最高的是在RT區(qū)。紐約市核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（NRTIs）耐藥相關(guān)突變?yōu)?0%，NNRTIs耐藥相關(guān)突變?yōu)?7.7%；天津市RTIs耐藥相關(guān)突變?yōu)?8%，NNRTIs耐藥相關(guān)突變?yōu)?4%[14]。本研究中突變最高的也在RT區(qū)，未出現(xiàn)NRTIs的耐藥突變，NNRTIs耐藥相關(guān)突變?yōu)?.46%。據(jù)資料顯示，當(dāng)PI突變單獨或者聯(lián)合出現(xiàn)都不能導(dǎo)致治療的早期失敗，但與主要耐藥相關(guān)突變同時出現(xiàn)則可能會提高毒株的適應(yīng)性，從而使復(fù)制水平提高，最后轉(zhuǎn)為耐藥[16]。本研究中，重慶市蛋白酶抑制劑（PIs）耐藥相關(guān)突變?yōu)?.0%。低于天津市的14%和紐約市的18.1%[14，17]。

本研究結(jié)果表明，HIV-1耐藥毒株已經(jīng)在重慶市MSM人群中發(fā)生了傳播。由于MSM人群特殊的性行為方式和其隱蔽性，這些因素不僅加速了HIV耐藥株在MSM人群內(nèi)部的蔓延，也有可能作為橋梁傳播給其他人群。因此應(yīng)加強MSM人群HIV-1耐藥毒株傳播的監(jiān)測和檢測，尤其是治療前檢測，這將有利于為患者選擇合適的治療方案，充分發(fā)揮抗病毒治療藥物的作用，控制和延緩MSM人群中耐藥株的流行。此外，應(yīng)加強對MSM人群行為學(xué)等方面的干預(yù)和治療患者的管理，防止HIV耐藥毒株的傳播。

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