張志鋒，孫業(yè)富，夏愛萍（.揚州市職業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇5009；.高郵市人民醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇5600）

肝衰竭患者救治困難，病死率高，其早期病死率達30%，而中、晚期的短期病死率更高，可達50%以上。由于內(nèi)科治療效果往往不佳，肝臟移植是目前唯一有效的治療方法[1-3]。因此，及時、準確地對肝衰竭的發(fā)生進行預(yù)測并采取恰當?shù)氖侄渭皶r治療，將提高患者的生命質(zhì)量。目前，人們對于輔助性 T細胞（Th）22、Th17、Th1在乙型肝炎病毒（HBV）相關(guān)肝臟疾病中的作用已有不同程度的了解[4-6]，但對于其與HBV-慢加亞急性肝衰竭（HBV-SACLF）的關(guān)系、預(yù)測HBV-SACLF的發(fā)生及對病情嚴重性和進展判斷方面的作用所知甚少。本研究通過檢測HBV-SACLF患者外周血Th22、Th1、Th17細胞水平，初步分析Th22、Th1、Th17細胞在HBVSACLF中的作用及三者之間的關(guān)系。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2015年3月至2016年2月在高郵市人民醫(yī)院住院的普通乙型肝炎患者30例（乙型肝炎組）、HBV-SACLF患者39例（HBV-SACLF組）及體檢健康人群30例（健康對照組）作為研究對象。按照患者的病情及住院期間狀態(tài)，將39例HBV-SACLF患者分為早期15例、中期15例和晚期9例三組。以2015版的《慢性乙型肝炎防治指南》及2012版《肝衰竭診療指南》作為診斷標準[7-8]；所選患者全部排除其他病原體感染，以及排除自身免疫性疾病、酒精性肝病、原發(fā)性肝癌等；所選患者未含產(chǎn)婦、哺乳期婦女及合并有如心臟病等其他嚴重疾病患者。所有試驗對象或者家屬都簽署知情同意書。各組在年齡、性別構(gòu)成方面比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），HBV-SACLF組谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、總膽紅素（TBIL）、清蛋白（ALB）、HBV-DNA 及終末期肝模型（MELD）評分與乙型肝炎組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組一般資料比較

1.2 方法 Th22、Th17、Th1細胞檢測 從肘靜脈采取空腹血標本100 μL，加入等體積的1640培養(yǎng)液充分混勻，再加入 PMA（50 ng/mL）、離子霉素（50 μg/mL）、莫能霉素（0.1 μg/mL）后，在 37℃、5%CO2孵箱中孵育5 h，收集細胞，經(jīng)磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗滌后，加入CD4-FITC、CD8-APC、CD3-PE-CY7 抗體，輕輕振蕩混勻，4℃避光孵育30 min。經(jīng)細胞表面標記后，每管加入1 mL Fixation/Permeabilization工作液，輕輕振蕩混勻，4℃避光孵育30 min。離心5 min，棄去上清液，振蕩重懸細胞。加入適量 IFN-γ-PE-CY5、IL-17-PE、IL-22，振蕩1～2 s，避光孵育 20 min，用 PBS 洗滌細胞，離心 5 min，傾去上清液。重懸細胞于鞘液中，利用流式細胞儀檢測。試驗象限確定依據(jù)用于試驗的相應(yīng)熒光對照，資料采用MXP軟件分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布的計量資料以±s表示，偏態(tài)分布以M（P25，P75）表示，組間比較采用t檢驗或U檢驗，變量間的相關(guān)性采用Pearson直線相關(guān)分析。采用MedCal統(tǒng)計軟件繪制受試者工作特征曲線（ROC曲線）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 三組間Th22、Th1、Th17水平比較 乙型肝炎組、HBV-SACLF組患者外周血Th22、Th1、Th17水平明顯高于健康對照組，HBV-SACLF組患者外周血Th22、Th1、Th17水平明顯高于乙型肝炎組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 三組間 Th22、Th1、Th17 水平比較（±s，%）

表2 三組間 Th22、Th1、Th17 水平比較（±s，%）

注：與健康對照組比較，aP＜0.05；與乙型肝炎組比較，bP＜0.05

組別健康對照組乙型肝炎組SACLF組Th1 3.40±1.31 5.51±1.89a 8.92±3.11ab Th17 3.38±1.62 6.67±1.66a 8.92±2.77ab Th22 2.34±1.10 5.22±1.76a 7.85±3.22ab

2.2 HBV-SACLF不同時期Th22、Th1、Th17水平比較HBV-SACLF晚期Th22、Th1、Th17水平明顯高于中期和早期，中期Th22、Th1、Th17水平明顯高于早期，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 HBV-SACLF 不同時期 Th22、Th1、Th17 水平比較（±s，%）

表3 HBV-SACLF 不同時期 Th22、Th1、Th17 水平比較（±s，%）

注：與HBV-SACLF早期組比較，aP＜0.05；與HBV-SACLF中期組比較，bP＜0.05

組別HBV-SACLF早期組HBV-SACLF中期組HBV-SACLF晚期組Th1 6.63±0.61 7.82±0.56a 10.52±2.34ab Th17 6.71±0.99 8.59±0.57a 9.94±1.29ab Th22 5.65±1.28 6.99±0.97a 9.11±1.22ab

2.3 HBV-SACLF患者外周血Th22、Th1、Th17之間的關(guān)系 在HBV-SACLF患者外周血中Th1與Th17、Th22呈明顯正相關(guān)（r=0.715，P＜0.000 1；r=0.579，P=0.000 7）；Th17與Th22呈明顯正相關(guān)（r=0.693，P＜0.0001），見圖1。

圖1 HBV-SACLF患者外周血Th22、Th1、Th17之間的關(guān)系

2.4 HBV-SACLF外周血T細胞與相關(guān)指標的關(guān)系 Th22、Th1、Th17分別與 TBIL、MELD 評分呈正相關(guān)（P＜0.05），與 ALB 呈負相關(guān)（P＜0.05），與 AST、ALT 及 HBV-DNA無相關(guān)性（P＞0.05）。見表4。

表4 HBV-SACLF患者外周血T細胞與相關(guān)指標的關(guān)系

2.5 Th22、Th1、Th17對SACLF的預(yù)測價值 以臨床診斷作為“金標準”繪制ROC曲線，結(jié)果顯示，Th1、Th17、Th22檢測對SACLF發(fā)生有預(yù)測作用，曲線下面積（AUC）分別為 0.817、0.802、0.753。以 Th1、Th17、Th22為自變量，建立Logistic回歸模型，擬合方程Logit（P）=6.404-0.459 8×Th17+0.118 6×Th1-0.377 8×Th22，聯(lián)合預(yù)測AUC為0.854，聯(lián)合檢測ROC曲線AUC與Th1、Th17、Th22單項檢測AUC比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖 2、表5。

3 討 論

圖 2 Th22、Th1、Th17的 ROC 曲線

表5 Th22、Th1、Th17對SACLF的預(yù)測價值

Th17細胞是一種獨特的CD4+效應(yīng)T細胞，其能分泌 IL-17、IL-22、IL-26 和腫瘤壞死因子 α（TNF-α）等細胞因子，其中，IL-17是Th17最具特征性的細胞因子。研究表明，Th17細胞及其相關(guān)細胞因子與慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎、缺血/再灌注肝損傷、自身免疫性肝病等肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[9]。Th22是一種近年來新發(fā)現(xiàn)的CD4+T細胞，其能夠特異性分泌IL-22。正常情況下，Th22與Th1、Th2、Th17等其他T細胞亞群互相調(diào)控，使機體處于平衡狀態(tài)。在炎性疾病、自身免疫性疾病和感染性疾病中，Th22通過分泌IL-22、TNF-α、IL-26等效應(yīng)因子參與疾病的進程[10]。Th1細胞為傳統(tǒng)的Ⅰ型輔助性T淋巴細胞，其能分泌IFN-γ，促進CD8+T細胞增殖分化為CTL細胞，以清除感染病毒的靶細胞，從而造成組織損傷[11]。研究發(fā)現(xiàn)，在HBV感染細胞后，患者外周血中Th1水平明顯增高，且在急性肝衰竭中增高幅度更大，表明Th1在肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用[12-13]。在本研究中，HBV-SACLF組外周血Th22、Th1、Th17水平明顯高于乙型肝炎組和健康對照組；在 HBV-SACLF早、中、晚期 Th22、Th1、Th17 水平也逐漸升高，且Th22、Th1、Th17分別與TBIL呈正相關(guān)，與ALB呈負相關(guān)，提示Th22、Th1、Th17參與了肝臟損傷的發(fā)展過程，其水平能夠反映疾病的嚴重程度和肝臟的儲備功能。MELD評分是臨床應(yīng)用最為廣泛的肝病病情評估及預(yù)后判斷的評分模型，MELD評分越高，肝病預(yù)后越差。本研究結(jié)果顯示，外周血Th22、Th17及Th1與MELD評分呈正相關(guān)，提示HBV-SACLF患者外周血Th22、Th17及Th1水平與疾病的預(yù)后相關(guān)。本研究中，作者還對Th22、Th1、Th17之間的關(guān)系進行了研究，結(jié)果顯示，在HBV-SACLF中，Th22水平與Th1及Th17呈正相關(guān)，且Th1水平與Th17也呈正相關(guān)，提示在HBV-SACLF發(fā)病進程中，Th22、Th1、Th17可能起協(xié)同作用。這可能是因為在HBV-SACLF發(fā)生、發(fā)展中，相關(guān)免疫細胞被活化，分泌的細胞因子如IL-6、IL-12、IL-21等能夠促進Th22、Th1、Th17的增殖、分化，這3類細胞能夠分泌多種細胞因子介導(dǎo)肝臟損傷。例如，IFN-γ能增強Tc細胞的增殖，加重肝臟細胞損傷；IL-17，IL-22能誘導(dǎo)炎性細胞因子、趨化因子等導(dǎo)致肝臟的炎性損傷。至于三者間確切的作用機制此后還需進一步研究。

肝衰竭發(fā)病機制復(fù)雜，病情進展至肝衰竭時，短期病死率極高。因此，需對HBV-SACLF發(fā)生風(fēng)險進行預(yù)測，并采取措施對高風(fēng)險的感染者進行早期干預(yù)，從而達到預(yù)防肝衰竭發(fā)生的目的。相關(guān)研究報道，在肝衰竭發(fā)生前給予患者短時小劑量激素治療能夠明顯降低肝衰竭的發(fā)生率，肝衰竭前期抗病毒治療能明顯改善患者的預(yù)后，提高其生存率。本研究通過比較各指標ROC曲線AUC，判斷其對肝衰竭的預(yù)測價值。文獻報道，ROC曲線AUC為0.5以下時無診斷價值，AUC為0.5～0.7時有較低的準確性，AUC為大于0.7～0.9時有較高的準確性，AUC為0.9以上時準確性最高[14]。本研究結(jié)果顯示，Th22、Th1、Th17 的 AUC 分別為 0.817、0.802、0.753，提示 Th22、Th1、Th17 在 HBV-SACLF 預(yù)測方面有一定的價值。聯(lián)合檢測的ROC曲線AUC雖然高于任一單項檢測，但與單項檢測的AUC比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），提示聯(lián)合檢測的預(yù)測價值并不優(yōu)于單項檢測，不過在研究中作者發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測有較高的敏感度。

綜上所述，Th22、Th1、Th17水平在 HBV-SACLF 患者外周血中升高，其水平能夠反映HBV-SACLF的嚴重程度，且在預(yù)測HBV-SACLF發(fā)生方面有一定的價值。

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