周 君，徐 杰，張 瑜，劉 佳，郭大靜（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院放射科，重慶400010）

動(dòng)脈血栓嚴(yán)重威脅人類健康，可引起心肌梗死、缺血性腦卒中、肺栓塞等嚴(yán)重疾病，在世界范圍內(nèi)其發(fā)病率和病死率居高不下[1]。因此，早期準(zhǔn)確診斷、及時(shí)治療能挽救缺血壞死組織，減少并發(fā)癥，降低病死率。近年來，分子影像學(xué)的發(fā)展促進(jìn)了動(dòng)脈血栓的早期診斷及個(gè)體化治療。國內(nèi)外已有大量靶向診斷血栓的分子探針[2-5]，在此基礎(chǔ)上，本研究旨在利用聚乳酸/羥基乙酸（PLGA）為載體，制備載血栓親和性肽谷氨酸-色氨酸-纈氨酸-天冬氨酸-纈氨酸（EWVDV）的超聲及磁共振相變型多模態(tài)分子探針，以期借助多模態(tài)分子影像技術(shù)從分子及細(xì)胞水平實(shí)現(xiàn)對(duì)血栓的早期精準(zhǔn)診斷，為血栓性疾病的治療及預(yù)后判斷提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；激光粒徑儀（Zeta SIZER 3000HS，英國Malvern公司）；流式細(xì)胞儀（FSCS-Vantate SE，美國BD公司）；紅外儀（美國Fluke公司）；超聲儀（意大利Esaote公司）；光聲成像系統(tǒng)（Vevo Laser，加拿大 VisualSonics公司）；3.0T磁共振掃描儀（荷蘭Philips公司）。

1.1.2 試劑 羧基PLGA（配比75∶25，相對(duì)分子質(zhì)量為8 000，濟(jì)南岱罡生物材料有限公司）；有機(jī)物可溶性Fe3O4納米粒子（油酸表面修飾，美國Ocean NanoTech公司）；全氟己烷（PFH，美國Elf Atochem公司）；印度墨水（美國Amresco公司）；GA修飾的EWVDV肽（上海吉爾生化有限公司）；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、2-（N-嗎啡啉）乙磺酸（MES）、聚乙烯醇（PVA）及 DiI染色劑均購于美國Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 多模態(tài)納米粒的制備及表征

1.2.1 非靶向多模態(tài)納米粒的制備 采用三步乳化法，首先取200 μL 10%印度墨水加入200 μL PFH，聲振70 s（功率100 W）形成黑色乳液；將100 mg PLGA加入3 mL二氯甲烷，待其完全溶解后加入80 μL經(jīng)油酸修飾的Fe3O4，振搖20 min，使其充分混合；然后倒入上述黑色乳液，聲振70 s形成深灰色初乳；最后加入10 mL 4%PVA溶液，聲振70 s，形成淺灰色乳液；加入20 mL 2%異丙醇，將上述溶液置于通風(fēng)櫥攪拌2 h，使有機(jī)溶劑充分揮發(fā)，全程冰浴。再經(jīng)雙蒸水洗滌、離心3次，得非靶向納米粒（PFH-Ink-Fe）。制備PFH-Fe及PFH-Ink納米粒時(shí)分別省去印度墨水及Fe3O4的投入，其他步驟同上；將制備的納米粒置于4℃冰箱內(nèi)儲(chǔ)存?zhèn)溆谩iI染色非靶向納米粒制備在溶解PLGA時(shí)加入少量DiI。

1.2.2 靶向血栓多模態(tài)納米粒制備 采用碳二亞胺法[6]，取少量PFH-Ink-Fe納米粒分散在10 mL MES緩沖液（0.1 mol/L，pH=5.0）中，加入過量的偶聯(lián)活化劑EDC/NHS（質(zhì)量比2∶1）于4℃孵育2 h，用雙蒸水離心、洗滌去除未反應(yīng)的EDC/NHS，將活化后的PFH-Ink-Fe納米粒分散于10 mL MES緩沖液（0.1 mol/L，pH=8.0）中，加入適量GA修飾及羅丹明標(biāo)記的EWVDV肽置于搖床上孵育1 h，用雙蒸水離心、洗滌去除未反應(yīng)的EWVDV肽，即得靶向血栓多模態(tài)分子探針（EWVDVPFH-Ink-Fe），EWVDV-PFH-Fe、EWVDV-PFH-Ink 納米

粒的制備方法同上；將制備好的納米粒置于4℃冰箱內(nèi)儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 靶向血栓多模態(tài)納米粒理化性質(zhì)表征 （1）觀察納米粒形態(tài)、大小及分散性。（2）檢測(cè)納米粒的粒徑及粒徑分布。（3）檢測(cè)羅丹明標(biāo)記的EWVDV的連接率。

1.3 熱致相變 取50 μL 10 mg/mL EWVDV-PFH-Ink-Fe納米粒滴在載玻片上，用加熱板分別加熱到50、55、60、65、70、75、80 ℃，于每組溫度下加熱 2、3、4、5、6、7 min時(shí)各采1次圖。觀察相變微泡大小。

1.4 光致相變及超聲成像

1.4.1 激光輻照時(shí)間與納米粒溫度關(guān)系 將200 μL 10mg/mLEWVDV-PFH-Ink-Fe納米粒加入孔徑為0.5cm2的瓊脂糖凝膠孔洞模型內(nèi)，采用808 nm激光儀，將激光探頭固定于模型正上方4 cm處，分別用輻照強(qiáng)度A=0.444 W/cm2、B=0.930 W/cm2、C=1.294 W/cm2、D=1.730 W/cm2對(duì)EWVDV-PFH-Ink-Fe納米粒進(jìn)行激光輻照，同時(shí)用紅外儀記錄溫度變化，每隔10 s采圖1次，共30次，組合為激光輻照時(shí)間與納米粒熱致相變光鏡圖。

1.4.2 激光輻照后納米粒溫度與超聲成像研究 將200 μL 10 mg/mL EWVDV-PFH-Ink-Fe納米粒加入孔徑為0.5 cm2的瓊脂糖凝膠孔洞模型內(nèi)，將激光探頭固定于模型正上方4 cm處對(duì)樣品進(jìn)行激光輻照，同時(shí)用紅外儀記錄實(shí)時(shí)溫度，當(dāng)樣品溫度達(dá)到 50、55、60、65、70、75、80℃時(shí)，用超聲儀分別在B模式和造影模式下采集超聲聲像圖，采用DFY超聲圖像定量分析軟件測(cè)量圖像聲強(qiáng)度。

1.5 納米粒光聲成像及磁共振成像研究

1.5.1 納米粒光聲成像 將200μL10mg/mL的EWVDVPFH-Ink-Fe納米粒加入孔徑為0.5 cm2的瓊脂糖凝膠孔洞模型內(nèi)，激光輻照60 s，激發(fā)波長706 nm，用光聲成像系統(tǒng)采集圖像。

1.5.2 納米粒磁共振成像 分別將3 mL雙蒸水及3 mL質(zhì)量濃度分別為 0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL 的 EWVDVPFH-Ink-Fe納米粒加入Eppendorf管中，每管均用8%明膠溶液定容至4 mL，充分混勻，避免納米粒發(fā)生沉降，以雙蒸水為背景，置于3.0T磁共振掃描儀上行T2WI掃描，采用頭顱專用單通道正交線圈，F(xiàn)FE序列。掃描參數(shù)：TR=87 ms，TE=9 ms，翻轉(zhuǎn)角度（FP）45°，體素0.6 mm×0.6 mm×3.0 mm，矩陣 147×147，激勵(lì)次數(shù) 4次。

1.6 納米粒對(duì)體外血栓靶向性 取新西蘭大白兔耳緣靜脈血10 mL，加至20 mL燒杯中，37℃孵育5 h至血栓形成。將血栓切成10 mm×10 mm大小，分別加入5 mL 10 mg/mL均經(jīng) DiI染色的PFH-Ink-Fe納米粒和EWVDV-PFH-Ink-Fe納米粒中孵育30 min，37℃水浴。

取出血栓，用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）反復(fù)沖洗，去除游離納米粒。將血栓做冰凍切片，在普通光鏡和熒光顯微鏡下觀察。為防止切片變干，部分切片上滴加少量雙蒸水。

2 結(jié) 果

2.1 納米粒的理化特性 EWVDV-PFH-Ink-Fe納米粒在光鏡下顯示其粒徑較均一，表面光滑，呈球形，分散性好，激光粒徑儀測(cè)得微球的平均粒徑為370.7 nm，PDI=0.172。流式細(xì)胞儀測(cè)得羅丹明標(biāo)記的EWVDV的連接率為62.5%。

2.2 熱致相變 光鏡下見EWVDV-PFH-Ink-Fe納米粒在各個(gè)溫度組下不同加熱時(shí)間點(diǎn)均變成微泡，相變納米粒的數(shù)量由少變多，體積從小到大，并向中心聚集，部分體積較大的微泡破裂產(chǎn)生射流現(xiàn)象，沖擊周圍的微泡。在相同溫度下，加熱時(shí)間越長，相變納米粒的數(shù)目越多，直徑越大；在相同的加熱時(shí)間下，隨著溫度升高，相變納米粒數(shù)目越多，直徑越大，見圖1。納米粒相變后直徑從數(shù)十微米到數(shù)百微米不等，較大的微泡可達(dá)210 μm左右。

圖1 EWVDV-PFH-Ink-Fe納米粒熱致相變光鏡圖

2.3 光致相變及超聲成像

2.3.1 激光輻照時(shí)間與納米粒溫度關(guān)系 在A=0.444 W/cm2、B=0.930 W/cm2、C=1.294 W/cm2、D=1.730 W/cm2等4組不同輻照強(qiáng)度下，EWVDV-PFH-Ink-Fe納米粒溫度在實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)均逐漸升高，且輻照功率越高溫度升高幅度越大，速度越快。在輻照強(qiáng)度為1.730 W/cm2時(shí)，納米粒于280 s達(dá)到最高溫度91.7℃，見圖2。

圖2 激光輻照時(shí)間與EWVDV-PFH-Ink-Fe納米粒溫度關(guān)系

2.3.2 激光輻照后納米粒溫度與超聲成像研究 當(dāng)激光輻照后EWVDV-PFH-Ink-Fe納米粒溫度為50、55℃時(shí)，肉眼未見明顯相變微泡，超聲儀未探測(cè)到明顯回聲信號(hào)；當(dāng)納米粒溫度達(dá)到60～80℃時(shí)，在凝膠模型上方可見白色、大小均勻相變微泡，B模式及造影模式下均探及微泡產(chǎn)生的強(qiáng)回聲；超過60℃后B模式下回聲強(qiáng)度明顯升高，并保持在相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，而造影模式下回聲強(qiáng)度隨溫度的增高而逐漸升高，見圖3。

圖3 激光輻照EWVDV-PFH-Ink-Fe納米粒達(dá)到不同溫度時(shí)B模式及對(duì)比模式下聲像圖

2.4 納米粒光聲成像及磁共振成像

2.4.1 納米粒光聲成像 光聲成像系統(tǒng)可檢測(cè)到EWVDV-PFH-Ink-Fe納米粒的紅色光聲信號(hào)，證實(shí)了Fe3O4和印度墨水的光聲成像能力。見圖4。

圖4 EWVDV-PFH-Ink-Fe納米粒光聲成像圖

2.4.2 納米粒磁共振成像 磁共振掃描示各組不同水平EWVDV-PFH-Ink-Fe納米粒信號(hào)與雙蒸水信號(hào)比較均有不同程度降低，且隨樣品中納米粒水平的增加，T2信號(hào)的降低越發(fā)明顯，證實(shí)該納米?？捎行Ы档蚑2信號(hào)。見圖5。

圖5 EWVDV-PFH-Ink-Fe納米粒磁共振掃描圖

2.5 納米粒對(duì)體外血栓靶向性 經(jīng)過熒光顯微鏡綠光激發(fā)后，PFH-Ink-Fe組因?yàn)槲锢砦阶饔茫谘ū砻婵梢娚倭奎S色熒光，EWVDV-PFH-Ink-Fe組可見大量熒光納米粒連接于血栓表面，明顯多于PFH-Ink-Fe組，表明多功能納米粒對(duì)血栓有良好靶向性。為防止血栓切片變干，作者在部分切片上滴了少量雙蒸水后，發(fā)現(xiàn)切片上的探針發(fā)生了相變，且進(jìn)入血栓內(nèi)部，見圖6。

圖6 靶向組納米粒（EWVDV-PFH-Ink-Fe）及非靶向納米粒（PFH-Ink-Fe）對(duì)體外血栓靶向性

3 討 論

核磁共振成像分子影像學(xué)具有較高的組織分辨率、多參數(shù)、多方位成像等優(yōu)點(diǎn)，可同時(shí)獲得解剖及生理信息，本課題組前期通過磁共振分子成像技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)血栓的靶向診斷及治療研究[6-8]，但磁共振掃描耗時(shí)較長，敏感度較低。超聲分子影像作為分子影像學(xué)的一個(gè)重要分支，在近幾年得以興起和快速發(fā)展，但目前使用的超聲微泡造影劑存在粒徑大、穩(wěn)定性差等不足；而單純光聲成像存在穿透力較弱等劣勢(shì)。單一影像學(xué)成像模式已不能滿足臨床多樣化和個(gè)體化需求，多種成像模式聯(lián)合應(yīng)用能夠互補(bǔ)不足，更全面地提供血栓的病理生理學(xué)信息[9-12]。目前國內(nèi)鮮有血栓多模態(tài)分子探針的報(bào)道。本研究聯(lián)合超聲、光聲及磁共振成像技術(shù)，期望從分子水平上實(shí)現(xiàn)對(duì)血栓更全面的影像學(xué)表征。

在本研究納米粒的超聲成像研究中，經(jīng)激光輻照后納米粒的溫度達(dá)到或高于60℃時(shí)，在B模式和對(duì)比模式下可獲得令人滿意的回聲信號(hào)，而在60℃以下則未探測(cè)到明顯的強(qiáng)回聲，有學(xué)者認(rèn)為激光輻照致相變的原理是納米粒中的吸光物質(zhì)吸收光的能量轉(zhuǎn)化為熱能，使納米粒中的氟碳物質(zhì)溫度升高，發(fā)生相變[13]。本研究結(jié)果顯示，激光輻照強(qiáng)度為0.930、1.294、1.730 W/cm2時(shí)，分子探針分別在120、70、40 s時(shí)達(dá)到60℃，而當(dāng)激光輻照強(qiáng)度為0.444 W/cm2時(shí)，分子探針在實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)不能達(dá)到60℃。由此可以看出，為了獲得令人滿意的超聲圖像，激光照射強(qiáng)度和時(shí)間需要滿足相應(yīng)的要求，激光輻照時(shí)間越長，輻射強(qiáng)度越大，納米粒溫度越高，而回聲信號(hào)越明顯。激光輻照后納米粒溫度的明顯升高也說明了納米粒對(duì)激光能量有良好的吸收能力，這種優(yōu)異的光吸收特性不僅有利于超聲成像，還在光熱療領(lǐng)域具有很大的潛力。

Fe3O4和印度墨水均可用于光聲成像[14-15]，EWVDVPFH-Ink-Fe納米粒在光聲成像儀中可觀測(cè)到紅色光聲信號(hào)，同時(shí)，F(xiàn)e3O4也可用作磁共振對(duì)比劑，在納米粒磁共振成像中，不同水平EWVDV-PFH-Ink-Fe納米粒信號(hào)與雙蒸水背景信號(hào)比較均有不同程度的降低，且隨樣品水平的增加，T2信號(hào)的降低越發(fā)明顯，證實(shí)該納米?？捎行Ы档蚑2信號(hào)，該結(jié)果與大量國內(nèi)外研究一致[16-18]，證實(shí)了納米粒中的Fe應(yīng)用于磁共振成像中具有優(yōu)良的有效性及穩(wěn)定性，這也歸因于經(jīng)油酸修飾的Fe3O4鑲嵌于PLGA殼中，不會(huì)發(fā)生明顯的突釋現(xiàn)象。

在熱致相變研究中，由于樣品加熱到設(shè)定溫度需要一定時(shí)間，所以1 min圖像的研究意義不大；而加熱后期樣品會(huì)被加熱板烤干，相變納米粒不穩(wěn)定，所以選擇條件穩(wěn)定的時(shí)間（2～7 min）作為研究時(shí)間段。隨著加熱時(shí)間延長及加熱溫度的上升，發(fā)生相變的納米粒數(shù)目越多且直徑越大，這一規(guī)律有助于指導(dǎo)納米粒在體內(nèi)的應(yīng)用，當(dāng)納米粒應(yīng)用于體內(nèi)時(shí)，需發(fā)生相變才能實(shí)現(xiàn)超聲顯像。但納米粒相變后的粒徑需控制在一定范圍內(nèi)，避免粒徑過大引起血管阻塞，而這一結(jié)果為納米粒的相變可控性提供了重要依據(jù)。然而體內(nèi)環(huán)境復(fù)雜，納米粒在體內(nèi)的相變及超聲成像待后期工作進(jìn)一步探索。

文獻(xiàn)研究顯示，活化血小板表面同時(shí)高表達(dá)GPⅡb/Ⅲa受體和P-選擇素[19]。前期研究利用RGDS/cRGD肽成功構(gòu)建靶向血栓中激活血小板GPⅡb/Ⅲa受體的納米粒，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)顯示其靶向性能良好[6-8]，但是動(dòng)脈中血液流速高，需要更強(qiáng)的靶向力以抵抗動(dòng)脈血液的高剪切力，P-選擇素是黏附分子選擇素家族的重要成員，其主要表達(dá)在活化的血小板/內(nèi)皮細(xì)胞表面，通過介導(dǎo)細(xì)胞初始黏附啟動(dòng)參與了包括白細(xì)胞的黏附遷移級(jí)聯(lián)過程，選擇素及其配體的靶向作用可以介導(dǎo)細(xì)胞滾動(dòng)[20-21]。EWVDV肽對(duì)P-選擇素有高度的親和力，而不會(huì)靶向L-選擇素和E-選擇素，且比其他肽段、糖類物質(zhì)及內(nèi)源性配體二硫鍵連接的唾液黏蛋白二聚體-1（PSGL-1）的靶向性更強(qiáng)[22]。N 端修飾 GA 或羧酸（CA）的EWVDV對(duì)P-選擇素的靶向能力最強(qiáng)，其靶向性可提高800多倍[22]。本研究體外靶向血栓實(shí)驗(yàn)證實(shí)，EWVDV-PFH-Ink-Fe納米粒的靶向性能明顯高于PFHFe，作者推測(cè)這正是由于EWVDV與P-選擇素的靶向結(jié)合作用介導(dǎo)了納米粒在血栓表面的黏附、滾動(dòng)，使得納米粒穩(wěn)定地結(jié)合于血栓表面。在體外靶向血栓實(shí)驗(yàn)中，為了防止血栓切片變干，作者在部分切片上滴了少量雙蒸水后，意外發(fā)現(xiàn)切片上的探針發(fā)生了相變，且進(jìn)入血栓內(nèi)部，作者認(rèn)為這歸因于印度墨水及Fe3O4吸收綠光能量后發(fā)生了光致相變作用，同樣證明了探針具有優(yōu)良的光吸收能力，且通過這種相變作用可以促使納米粒向血栓內(nèi)部滲透。目前多數(shù)血栓分子探針對(duì)血栓的靶向均富集于血栓表面[23-26]，CHUNG等[24]的研究證實(shí)，其制備的探針可以向血栓內(nèi)部滲透達(dá)300 μm。本研究中，借助相變作用，納米?？纱罅肯蜓ㄉ畈繚B透，這為靶向溶栓效率的大幅提高奠定了基礎(chǔ)。然而，這種相變介導(dǎo)的納米粒向血栓深部滲透的機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。EWVDV-PFH-Ink-Fe納米粒在體內(nèi)的靶向及顯影性能、代謝分布及安全性會(huì)在下一步進(jìn)行詳細(xì)驗(yàn)證。

[1]WENDELBOE AM，RASKOB GE.Global burden of thrombosis：epidemiologic aspects[J].Circ Res，2016，118（9）：1340-1347.

[2]AY I，BLASI F，RIETZ TA，et al.In vivo molecular imaging of thrombosis and thrombolysis using a fibrin-binding positron emission tomographic probe[J].Circ Cardiovasc Imag，2014，7（4）：697-705.

[3]REZAEIANPOUR S，BOZORGI AH，MOGHIMI A，et al.Synthesis and biological evaluation of cyclic[Tc-99m]-HYNIC-CGPRPPC as a Fibrin-Binding peptide for molecular imaging of thrombosis and its comparison with[Tc-99m]-HYNIC-GPRPP[J].Mol Imaging Biol，2017，19（2）：256-264.

[4]TANG RB，CHAI WM，YAN FH，et al.Molecular evaluation of thrombosis using X-ray phase contrast imaging with microbubbles targeted to P-selectin in mice[J].Eur Radiol，2016，26（9）：3253-3261.

[5]趙元平，胡廣全，滕中華，等.環(huán)RGD多肽靶向微泡用于動(dòng)脈血栓成像[J].中國醫(yī)學(xué)影像技術(shù)，2013，29（6）：857-861.

[6]ZHOU J，GUO DJ，ZHANG Y，et al.Construction and evaluation of Fe3O4-based PLGA nanoparticles carrying rtPA used in the detection of thrombosis and in targeted thrombolysis[J].ACS Appl Mater Interfaces，2014，6（8）：5566-5576.

[7]LIU J，XU J，ZHOU J，et al.Fe3O4-based PLGA nanoparticles as Mr contrast agents for the detection of thrombosis[J].Int J Nanomedicine，2017，12（1）：1113-1126.

[8]ZHANG Y，ZHOU J，GUO DJ，et al.Preparation and characterization of gadolinium-loaded PLGA particles surface modified with RGDS for the detection of thrombus[J].Int J Nanomedicine，2013，8（1）：3745-3756.

[9]SONG YN，HUANG ZY，XU JF，et al.Multimodal SPION-CREKA peptide based agents for molecular imaging of microthrombus in a rat myocardial ischemia-reperfusion model[J].Biomaterials，2014，35（9）：2961-2970.

[10]YOO SP，PINEDA F，BARRETT JC，et al.Gadolinium-functionalized peptide amphiphile micelles for multimodal imaging of atherosclerotic lesions[J].ACS omega，2016，1（5）：996-1003.

[11]OLIVEIRA BL，BLASI F，RIETZ TA，et al.Multimodal molecular imaging reveals high target uptake and specificity of 111In-and 68Ga-Labeled Fibrin-Binding probes for thrombus detection in rats[J].J Nucl Med，2015，56（10）：1587-1592.

[12]MCCARTHY JR，PATEL P，BOTNARU I，et al.Multimodal nanoagents for the detection of intravascular thrombi[J].Bioconjug Chem，2009，20（6）：1251-1255.

[13]NIU C，WANG L，WANG Z，et al.Laser irradiated fluorescent perfluorocarbon microparticles in 2-D and 3-D breast cancer cell models[J].Scientific Reports，2017，7（1）：43408.

[14]ZHOU P，ZHAO H，WANG Q，et al.Photoacoustic-enabled self-guidance in magnetic-hyperthermia Fe@Fe3O4 nanoparticles for theranostics in vivo[J].Advan Healthcare Mater，2018，7（9）：e1701201.

[15]AVIGO C，LASCIO N，ARMANETTI P，et al.Organosilicon phantom for photoacoustic imaging[J].J Biomed Opt，2015，20（4）：46008.

[16]TA HT，LI Z，HAGEMEYER CE，et al.Molecular imaging of activated platelets via antibody-targeted ultra-small Iron oxide nanoparticles displaying unique dual MRI contrast[J].Biomaterials，2017，134（1）：31-42.

[17]YANG M，F(xiàn)AN QL，ZHANG RP，et al.Dragon fruit-like biocage as an Iron trapping nanoplatform for high efficiency targeted cancer multimodality imaging[J].Biomaterials，2015，69（1）：30-37.

[18]SUZUKI M，BACHELET-VIOLETTE L，ROUZET F，et al.Ultrasmall superparamagnetic Iron oxide nanoparticles coated with fucoidan for molecular MRI of intraluminal thrombus[J].Nanomedicine，2015，10（1）：73-87.

[19]STOETZER C，NICKEL K，WEI?IG A，et al.Olive oil-based lipid emulsions do not influence platelet receptor expression in comparison to medium and long chain triglycerides in vitro[J].Lipids，2016，51（11）：1241-1248.

[20]KLOPOCKI AG，YAGO T，MEHTA P，et al.Replacing a lectin domain residue in L-selectin enhances binding to P-selectin glycoprotein ligand-1 but not to 6-sulfo-sialyl Lewis x[J]. J Biol Chem，2008，283（17）：11493-11500.

[21]LINDNER J R.Contrast ultrasound molecular imaging of inflammation in cardiovascular disease[J].Cardiovasc Res，2009，84（2）：182-189.

[22]APPELDOORN CC，MOLENAAR TJ，BONNEFOY A，et al.Rational optimization of a short human P-selectin-binding peptide leads to nanomolar affinity antagonists[J].J Biol Chem，2003，278（12）：10201-10207.

[23]LI B，JUENET M，AID-LAUNAIS R，et al.Development of polymer microcapsules functionalized with fucoidan to target P-Selectin overexpressedincardiovasculardiseases[J].AdvHealthcMater，2017，6（4）：1-5.

[24]CHUNG TW，WANG SS，TSAI WJ.Accelerating thrombolysis with chitosan-coated plasminogen activators encapsulated in poly-（lactide-coglycolide）（PLGA）nanoparticles[J].Biomaterials，2008，29（2）：228-237.

[25]WEN AM，WANG YM，JIANG K，et al.Shaping bio-inspired nanotechnologies to target thrombosis for dual optical-magnetic resonance imaging[J].J Mater Chem B，2015，3（29）：6037-6045.

[26]CICHA IWONA.Thrombosis：novel nanomedical concepts of diagnosis and treatment[J].World J Cardiol，2015，7（8）：434-441.