孫 莎，韓兆方，李完波，葉 坤，林愛(ài)強(qiáng)，崔曉瑩，王志勇

(1.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門(mén) 361021；2.農(nóng)業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門(mén) 361021)

0 引言

長(zhǎng)期以來(lái)，性別一直是生命科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)命題。魚(yú)類(lèi)在動(dòng)物系統(tǒng)進(jìn)化中處于承前啟后的地位，其物種數(shù)量占已知脊椎動(dòng)物的1/2以上[1]，因而其性別決定的遺傳基礎(chǔ)及其機(jī)制研究一直廣受關(guān)注。大量研究表明，脊椎動(dòng)物的性別異型主要是進(jìn)化過(guò)程中的遺傳選擇造成的[2]，是胚胎、幼體和成體發(fā)育生長(zhǎng)過(guò)程中基因差異表達(dá)的產(chǎn)物[3]。與控制其他組織生長(zhǎng)發(fā)育的基因相比，涉及性腺分化發(fā)育的基因呈現(xiàn)明顯的多變性和可塑性[4]。

隨著研究的不斷深入，魚(yú)類(lèi)性別的關(guān)鍵基因除了轉(zhuǎn)錄因子家族中的“明星基因”，如sry基因[5]和dmrt1基因[6]等，很多非轉(zhuǎn)錄因子家族的基因也被發(fā)現(xiàn)在性別決定中起著非常重要的作用。其中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族(TGF-β)的成員在性別分化和發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著舉足輕重的作用，如呂宋青鳉(Oryziasluzonensis)[7]和裸蓋魚(yú)(Anoplopomafimbria)[8]中的gsdf基因，銀漢魚(yú)(Odontestheshatcheri)中的amhy基因[9]，紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)中的amhrⅡ基因[10]以及羅非魚(yú)Y染色體上重復(fù)的amh基因[11]等。TGF-β超家族成員在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡及細(xì)胞動(dòng)態(tài)平衡等方面發(fā)揮重要作用，其中bmp(bone morphogenetic proteins)、amh(antimüllerian hormone)等基因均涉及脊椎動(dòng)物性腺的分化過(guò)程[12]。gsdf(gonadal soma derived factor)基因作為T(mén)GF-β超家族中的一種細(xì)胞因子，最先在虹鱒(Oncorhynchusmyliss)的原始生殖細(xì)胞(primordial germ cell，簡(jiǎn)稱PGC)中被分離鑒定。在孵化后40d的虹鱒胚胎中，gsdf基因特異地在其性腺細(xì)胞表達(dá)，該基因?qū)τ诰S持虹鱒原始生殖細(xì)胞和精原細(xì)胞的正常增殖發(fā)育具有重要作用[13]。Yasushi等人[14]以尋找dmy基因下游的靶基因?yàn)槟康臉?gòu)建了青鳉各個(gè)發(fā)育時(shí)期的cDNA文庫(kù)，并從中篩選出與虹鱒gsdf基因同源的下游基因。為了進(jìn)一步揭示gsdf基因在青鳉性別分化中的作用，Yasushi等人成功克隆了青鳉的gsdf基因并檢測(cè)了該基因在青鳉發(fā)育各個(gè)時(shí)期的表達(dá)模式，研究結(jié)果表明gsdf基因在雄性青鳉的胚胎中高表達(dá)，而雌性個(gè)體中幾乎不表達(dá)，性逆轉(zhuǎn)的雄性個(gè)體中g(shù)sdf基因表達(dá)明顯下降。隨后在呂宋青鳉(O.luzonensis)中，gsdf被發(fā)現(xiàn)取代了dmy成為該物種的性別決定主效基因[13]。該研究結(jié)果再次揭示和肯定了gsdf基因在魚(yú)類(lèi)性別分化過(guò)程的重要角色。利用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向敲除羅非魚(yú)中的gsdf基因，導(dǎo)致遺傳雄性(XY)的個(gè)體發(fā)生性逆轉(zhuǎn)，過(guò)表達(dá)gsdf基因致使遺傳為雌性(XX)個(gè)體的性腺發(fā)育為精巢，表明gsdf基因在羅非魚(yú)的性別決定中也發(fā)揮了關(guān)鍵的作用[15]。因此，探索gsdf基因在魚(yú)類(lèi)性別決定通路中的角色，對(duì)解析性別決定和分化的分子機(jī)理具有重要意義。

黃姑魚(yú)(Nibeaalbiflora)隸屬于鱸形目(Perciforms)、石首魚(yú)科(Sciaenidae)、黃姑魚(yú)屬(Nibea)，主要分布在我國(guó)沿海、朝鮮半島及日本南部海域[16]。黃姑魚(yú)表現(xiàn)出顯著的雌雄二態(tài)生長(zhǎng)模式，15月齡黃姑魚(yú)的雌性個(gè)體體重約是雄性個(gè)體的1.3倍[17]，開(kāi)展全雌化養(yǎng)殖，可望在不增加養(yǎng)殖量的情況下大幅度提高產(chǎn)量。高效地挖掘和篩選黃姑魚(yú)性別決定分化相關(guān)基因并探討其基因功能對(duì)于闡明黃姑魚(yú)性別決定的分子機(jī)理具有重要意義。本研究擬克隆黃姑魚(yú)gsdf基因的ORF序列全長(zhǎng)，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)一步檢測(cè)和分析該基因在不同組織和不同發(fā)育時(shí)期性腺中的表達(dá)情況，以期為闡明黃姑魚(yú)的性別決定和分化機(jī)理提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用的黃姑魚(yú)均為人工養(yǎng)殖個(gè)體，采自福建省寧德市金鈴水產(chǎn)科技有限公司。其中26日齡至390日齡的樣品均為2016年3月繁育的魚(yú)苗，育苗期間水溫22～25 ℃，鹽度為25～31。成魚(yú)(540日齡)為性成熟但未產(chǎn)卵的樣品，系來(lái)自2015年秋季繁育的魚(yú)苗。

黃姑魚(yú)遺傳性別鑒定的材料取自于其鰭條組織，置于95%的乙醇中，-20 ℃保存?zhèn)溆?。基因克隆的材料取自于性成熟黃姑魚(yú)的性腺組織，組織表達(dá)分析的材料取自于性成熟黃姑魚(yú)的性腺、肌肉、脾臟、胃、心臟、肝臟、腦、腎、眼和頭腎，不同發(fā)育階段的材料分別取自孵化后26 d、37 d、40 d、49 d、64 d、93 d、120 d、180 d(6月齡)、240 d(8月齡)、390 d(13月齡)及540 d(18月齡，性腺已發(fā)育成熟)的黃姑魚(yú)，這些材料置于RNA保護(hù)液中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

DNA提取試劑盒購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司；DNA凝膠回收試劑盒、GoScriptTMReverse Transcription System (Promega)購(gòu)自上海泰京生物技術(shù)有限公司；Trans Zol Up Plus RNA Kit、感受態(tài)細(xì)胞DH5α購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；TaqDNA聚合酶、pMD19-T、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)；引物由華大基因合成。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 黃姑魚(yú)遺傳性別鑒定

由于幼小的黃姑魚(yú)個(gè)體無(wú)法通過(guò)外部形態(tài)與性腺組織學(xué)觀察辨別其雌雄，需要通過(guò)提取基因組DNA并利用本實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)的黃姑魚(yú)性別特異分子標(biāo)記引物(見(jiàn)表1)對(duì)其進(jìn)行遺傳性別鑒定[18]。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)判定：遺傳雄性黃姑魚(yú)個(gè)體能檢測(cè)到一條258 bp的條帶，而遺傳雌性黃姑魚(yú)個(gè)體沒(méi)有擴(kuò)增條帶。

1.3.2 總RNA提取及cDNA鏈的合成

使用Trans Zol Up Plus RNA Kit試劑盒進(jìn)行RNA提取，使用GoScriptTMReverse Transcription System (Promega)試劑盒按照其說(shuō)明書(shū)合成cDNA的第一條鏈，后用內(nèi)參基因β-actin引物(序列見(jiàn)表1)檢測(cè)反轉(zhuǎn)錄效果。

表1 基因克隆和熒光定量所用到的引物

1.3.3 黃姑魚(yú)gsdf基因的克隆

利用生物信息學(xué)方法從本實(shí)驗(yàn)室的黃姑魚(yú)性腺轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究數(shù)據(jù)中獲得gsdf的開(kāi)放閱讀框序列，根據(jù)拼接的參考序列設(shè)計(jì)引物gsdf-orf-F/R(序列見(jiàn)表1)，以黃姑魚(yú)成魚(yú)的性腺cDNA為模板擴(kuò)增gsdf的開(kāi)放閱讀框片段。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后，利用DNA回收試劑盒純化回收并連入pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽(yáng)性克隆送到華大基因有限公司進(jìn)行測(cè)序。用DNAMAN軟件對(duì)測(cè)序所得數(shù)據(jù)和參考序列進(jìn)行比對(duì)分析，并使用Primer Premier 5.0軟件(http://www.premierbiosoft.com/)設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物gsdf-F/R(序列見(jiàn)表1)。

1.3.4gsdf基因的生物信息學(xué)分析

分析蛋白質(zhì)的物理參數(shù)：http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam；

預(yù)測(cè)信號(hào)肽：http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/；

分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域：用NCBI的Conserved Domains(CD-Search)程序；

序列同源性分析：DNAMAN軟件；

氨基酸多重序列比對(duì)：BioEidt軟件；

構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)：MEGA 5.0軟件(鄰接法，Neighbor-Joining，NJ)。

1.3.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR

選擇β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因(引物為β-actin-F/R，序列見(jiàn)表1)，使用LightCycler 480 (Roche，USA)熒光定量PCR儀，按照SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒使用說(shuō)明，采用qRT-PCR檢測(cè)gsdf基因在不同組織和不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況(引物gsdf-F/R序列見(jiàn)表1),每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算每個(gè)樣品目的基因的相對(duì)表達(dá)量，利用t-檢驗(yàn)分析比較各組織不同性別中g(shù)sdf基因的雌雄表達(dá)量差異。

2 結(jié)果

2.1 遺傳性別鑒定

對(duì)無(wú)法辨別性別的苗期個(gè)體進(jìn)行遺傳性別鑒定的結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，遺傳雄性個(gè)體可以檢測(cè)到1條258 bp左右的特異條帶，而遺傳雌性個(gè)體則沒(méi)有擴(kuò)增條帶。

2.2 gsdf基因的結(jié)構(gòu)

克隆獲得黃姑魚(yú)gsdf基因ORF長(zhǎng)度為648 bp，編碼215個(gè)氨基酸(見(jiàn)圖2)，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為22820.76 u，理論等電點(diǎn)(isoelectric point，pI)為5.22。黃姑魚(yú)的gsdf與GenBank中可查到基因組序列的其他7種魚(yú)類(lèi)的gsdf基因一樣，均包含5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子(見(jiàn)圖3)。黃姑魚(yú)gsdf編碼蛋白有一個(gè)信號(hào)肽，包含19個(gè)氨基酸(圖2中深色方框所示)。圖4為用ClustalW對(duì)12種不同魚(yú)類(lèi)GSDF氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)的結(jié)果，TGF-β超家族保守結(jié)構(gòu)域位于黃姑魚(yú)GSDF第114-204氨基酸處，圖4中星號(hào)標(biāo)注為9個(gè)保守的半胱氨酸殘基。表2為黃姑魚(yú)GSDF與其他10種魚(yú)類(lèi)GSDF、以及幾種魚(yú)類(lèi)AMH、TGF-β或BMP氨基酸序列比較分析的結(jié)果，從表2中可見(jiàn)：黃姑魚(yú)GSDF與鱸魚(yú)GSDF同源性最高，達(dá)70.2%；其次是石斑魚(yú)(67.6%)和牙鲆(64.5%)，與同屬于石首魚(yú)科的大黃魚(yú)GSDF同源性為63.4%，與斑馬魚(yú)GSDF的同源性最低(只有31.1%)，與魚(yú)類(lèi)TGF-β及AMH、BMP等其他TGF-β超家族成員的同源性則均低于20%。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(見(jiàn)圖5)分析結(jié)果顯示各種魚(yú)類(lèi)的GSDF同聚為一枝，而TGF-β超家族的其他成員分別聚為一枝；在GSDF分枝內(nèi)部，黃姑魚(yú)GSDF與大黃魚(yú)GSDF首先聚合為同一個(gè)小分枝，顯示兩者的親緣關(guān)系最近，而與斑馬魚(yú)的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

表2 黃姑魚(yú)GSDF氨基酸序列與其他魚(yú)類(lèi)GSDF及TGF-β超家族其他成員的同源性分析

物種SpeciesGenBank檢索號(hào)Accession number氨基酸同源性Amino acid homology/%Larimichthys crocea_GSDF本實(shí)驗(yàn)室[19]63.4Dicentrarchus labrax_GSDFAGA54135.170.2Epinephelus akaara_GSDFAIW52566.167.6Paralichthys olivaceus_GSDFARR75204.164.5Scophthalmus maximus_GSDFAJO67894.161.8Monopterus albus_GSDFALG62631.160.8Oryzias latipes_GSDFNP_001171213.157.0Halichoeres trimaculatus_GSDFBAM75186.156.4Oreochromis mossambicus_GSDFALO18792.154.0Danio rerio_GSDFAFI98392.131.1Oreochromis_niloticus_AMHCDI30241.116.5Danio_rerio_AMHAAT77729.212.6Oryzias_latipes_AMHNP_001098198.111.1Oncorhynchus_mykiss_TGFCAA67685.113.4Danio rerio_TGF-β2NP_919366.110.8Oryzias latipes_BMPNP_001098378.116.3Danio rerio_BMPBAA24406.116.1

2.3 gsdf基因在不同組織和不同發(fā)育階段的表達(dá)分析

2.3.1 不同組織中的表達(dá)情況

以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)黃姑魚(yú)gsdf基因在性腺、心臟、肝臟、脾臟、腎、胃、腦、肌肉、眼和頭腎共10個(gè)組織中的表達(dá)情況。結(jié)果如圖6所示，黃姑魚(yú)gsdf基因主要集中在精巢中表達(dá)，其表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于卵巢(P<0.001)。在雄魚(yú)的心臟、脾臟、眼、胃中也有比較明顯的表達(dá)，但與精巢相比其表達(dá)量都很低，其他組織中的表達(dá)量更低，肝臟中完全沒(méi)有檢測(cè)到表達(dá)；雌性黃姑魚(yú)各組織中g(shù)sdf的表達(dá)量都很低，除了在肌肉、胃和眼中的表達(dá)量與雄魚(yú)相近外，在腎臟、腦和卵巢中都只有痕量表達(dá)，在心臟和脾臟中的表達(dá)量也顯著低于雄性(P<0.01)。

2.3.2 不同發(fā)育時(shí)期性腺中的表達(dá)情況

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)gsdf基因在黃姑魚(yú)不同發(fā)育時(shí)期性腺中的表達(dá)量(見(jiàn)圖7)，結(jié)果進(jìn)一步顯示了該基因在雄性精巢中高表達(dá)的性別特異性表達(dá)特征。其中g(shù)sdf基因從孵化后第40天在雄魚(yú)性腺中開(kāi)始表達(dá)，第49天后表達(dá)量快速升高，在孵化后第120天表達(dá)量達(dá)到高峰，隨后開(kāi)始下降，在第180天時(shí)的表達(dá)量只有第120天時(shí)的35.3%，到第390天時(shí)表達(dá)量只有第120天時(shí)的8.3%，之后到第540天表達(dá)量基本保持穩(wěn)定。在整個(gè)發(fā)育過(guò)程中g(shù)sdf基因在卵巢中的表達(dá)量相對(duì)極低，幾乎檢測(cè)不到其表達(dá)。

3 討論

已有的研究表明，控制脊椎動(dòng)物性腺發(fā)育的基因及機(jī)制具有多變性和可塑性，往往那些本不參與性別決定的基因可能通過(guò)基因復(fù)制或突變等途徑跨越基因遺傳的層級(jí)而被招募成為新的性別決定開(kāi)關(guān)基因[20]，導(dǎo)致在分類(lèi)地位上相近、甚至同一個(gè)屬不同物種的魚(yú)類(lèi)其性別決定的基因都可能不一樣(如O.latipes[21]與O.luzonensis[22])。因此，每一個(gè)參與性別決定分化及發(fā)育的基因都具有深入剖析和研究的意義。

本研究首次克隆了黃姑魚(yú)gsdf基因，序列比對(duì)和同源性分析的結(jié)果顯示，黃姑魚(yú)gsdf基因具有TGF-β超家族保守功能結(jié)構(gòu)域和9個(gè)保守的半胱氨酸殘基，提示這些半胱氨酸殘基對(duì)于維持TGF-β超家族蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和行使其生理功能具有極其重要的作用。系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)黃姑魚(yú)gsdf基因同其他物種gsdf基因聚為一枝，明顯有別于TGF-β超家族的其他成員，由此可以推測(cè)黃姑魚(yú)gsdf與其他物種的gsdf有著同樣或相似的功能。有趣的是黃姑魚(yú)與大黃魚(yú)同屬于石首魚(yú)科，但其gsdf的氨基酸序列與大黃魚(yú)的相似性卻低于與鱸魚(yú)、石斑魚(yú)和牙鲆的相似性，這一方面說(shuō)明分類(lèi)地位很近的物種之間其基因和所編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列除了與功能密切相關(guān)的區(qū)域外，其余區(qū)域也可以有較大的變化和差異，另一方面是否也暗示黃姑魚(yú)與大黃魚(yú)的gsdf之間存在著具體功能上的差別，值得進(jìn)行比較研究。熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)黃姑魚(yú)gsdf基因在雄魚(yú)精巢中表現(xiàn)為特異性高表達(dá)，除性腺外，gsdf基因在心臟、脾臟、胃、眼和肌肉等其他器官/組織中也能檢測(cè)到一定量的表達(dá)，雌魚(yú)胃、眼、肌肉、心臟、脾臟等中也能檢測(cè)到少量的表達(dá)。作為T(mén)GF-β超家族的一員，這個(gè)結(jié)果與TGF-β超家族的成員對(duì)于細(xì)胞增殖分化、胚胎發(fā)育等多方面都起著重要作用的研究結(jié)論相一致，另一方面也提示該基因不太可能是黃姑魚(yú)性別決定的關(guān)鍵起始基因。組織學(xué)研究結(jié)果表明孵化后第36天為黃姑魚(yú)性別決定的關(guān)鍵時(shí)期，孵化后第61天在雄性黃姑魚(yú)中可觀察到無(wú)限性小葉組織的存在，標(biāo)志著黃姑魚(yú)雄性精巢開(kāi)始分化[23]。本研究發(fā)現(xiàn)黃姑魚(yú)gsdf基因在精巢未分化，孵化后第40天在雄魚(yú)性腺中開(kāi)始有明顯表達(dá)，孵化后第49天表達(dá)量迅速升高，到孵化后第120天表達(dá)量達(dá)到高峰，此時(shí)黃姑魚(yú)精巢已分化完成，正處于其快速發(fā)育和精原細(xì)胞快速增殖的階段。之后隨著精巢發(fā)育成型，gsdf基因的表達(dá)量顯著下降，但在精巢發(fā)育成熟之后仍保持著一定的表達(dá)量。這些結(jié)果提示gsdf基因與黃姑魚(yú)雄性性別分化與發(fā)育過(guò)程密切相關(guān)，同時(shí)對(duì)于維持精巢的繼續(xù)發(fā)育也有重要作用，因?yàn)辄S姑魚(yú)生殖細(xì)胞是分批成熟，在整個(gè)生活史中性腺首次發(fā)育成熟后，仍然不斷有新的生殖細(xì)胞生成與發(fā)育，但具體的作用機(jī)制，還有待今后深入研究。研究[19]表明大黃魚(yú)精巢的gsdf基因在孵化后第41天檢測(cè)有明顯表達(dá)，孵化后第49天表達(dá)量顯著升高，孵化后第123天達(dá)到高峰，隨后表達(dá)量逐漸下降，到精巢發(fā)育成熟后gsdf基因的表達(dá)量下降到只有第123天的10%左右，而在雌魚(yú)性腺中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于雄魚(yú)性腺。與大黃魚(yú)不同的是，黃姑魚(yú)雌魚(yú)在整個(gè)性腺分化、發(fā)育與成熟過(guò)程中g(shù)sdf基因都幾乎檢測(cè)不到其表達(dá)，或只有極少量的表達(dá)，其表達(dá)的性別特異性比大黃魚(yú)更加明顯，這也顯示出兩種魚(yú)之間的差異。關(guān)于什么是黃姑魚(yú)性別決定的關(guān)鍵起始基因，gsdf基因在黃姑魚(yú)性別決定和分化中的角色和具體功能是什么，還需進(jìn)一步研究闡明。本文為深入研究黃姑魚(yú)性別決定、發(fā)育與分化的分子機(jī)制提供了有益的資料。

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