陳發(fā)河，李 真，吳光斌

(集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021)

0 引言

海地瓜(Acaudinamolpadioides)，屬于棘皮動物門(Echinodermata)海參綱(Holothuroidea)芋參目(Molpadioides)[1]。作為我國大宗低值海參品種，海地瓜廣泛分布在我國山東、福建和廣東沿海，食用品質(zhì)較差。相關(guān)研究表明[2-6]，海地瓜體內(nèi)含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖、脂肪、皂苷、必需氨基酸、維生素和微量元素等活性組分，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值。由于海地瓜屬低值海參，口感較差，食用價(jià)值較低，因此，研究其中的功效成分的分離提取工藝技術(shù)，是實(shí)現(xiàn)低值海參資源高值化利用的有效途徑。

海參獨(dú)特的自溶現(xiàn)象，給運(yùn)輸與貯藏帶來極大不便。目前，海參加工產(chǎn)品主要有海參干品、海參冷凍制品、即食海參等傳統(tǒng)海參產(chǎn)品以及海參口服液、膠囊制劑等深加工功能性海參制品[7-8]。海參多糖是海參體壁的重要組成物質(zhì)，主要包括海參硫酸軟骨素及海參巖藻聚糖硫酸酯2種組分[9-10]，已證實(shí)海參多糖具有增強(qiáng)免疫力、抑制腫瘤、抗凝血、降血脂和預(yù)防組織老化等多種特殊功效[11-12]。海參體壁富含蛋白質(zhì)，干品中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)70%以上，是制備生物活性肽非常理想的原料[13-15]。海參活性肽的生物活性研究主要集中在降血壓、抗疲勞、提高免疫力、抗菌抗氧化等方面[16-18]。運(yùn)用海參自溶和外源酶酶解相結(jié)合的技術(shù)可有效制備海參多糖和活性多肽[13]。本文以海地瓜為原料，采用酶解和超濾相結(jié)合的方法，研究了聯(lián)合制備不同分子質(zhì)量段海地瓜多糖和多肽的工藝，并對不同分子質(zhì)量段海地瓜多糖及多肽的體外抗氧化活性進(jìn)行了比較分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海地瓜干品購自廈門中埔水產(chǎn)品批發(fā)市場。實(shí)驗(yàn)前洗凈體表與體內(nèi)的泥沙，去除內(nèi)臟，水發(fā)后剪成小塊，于45 ℃烘箱中烘至恒重，粉碎，過60目篩，制成海地瓜干粉，裝入自封袋，貯存于干燥器中備用。

木瓜蛋白酶(2×105U/g)，中性蛋白酶(2×105U/g)，南寧龐博生物工程有限公司；胰蛋白酶(2.5×105U/g)，北京索萊寶科技有限公司；牛血清蛋白、D-氨基葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、Tris-base，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Q-Sepharose-Fast-Flow凝膠(分裝進(jìn)口)，美國Pharmacia；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Cary50紫外可見分光光度計(jì)，美國Varian公司；TH-300A梯度混合儀、BT-100恒流泵、DBS-100部分收集器，上海青浦滬西儀器廠；層析柱(1.5 cm×40 cm、1.5 cm×70 cm)，上海方畦儀器有限公司；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；SHB-Ⅲ 循環(huán)水多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；超濾膜(UP010、US100、UV200、UP010、UP005、NP010) ，邁納德膜技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 總糖及蛋白質(zhì)含量的測定

總糖含量的測定采用苯酚-硫酸法[19]；蛋白質(zhì)含量的測定采用Folin-酚法[20]。

1.3.3 酶法提取海地瓜多糖和多肽

1.3.3.1 蛋白酶的篩選

選用胰蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶，根據(jù)酶制劑說明書提供的最佳酶解條件設(shè)計(jì)對比實(shí)驗(yàn)，以酶解液中總糖含量和蛋白質(zhì)含量為指標(biāo)確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)中蛋白酶的使用量。實(shí)驗(yàn)中均取10 g海參粉，料液比(m/V)為1∶40，用1 mol/L的鹽酸溶液和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值，加酶量為2%，在電熱恒溫振蕩水槽中酶解4 h后，置于100 ℃沸水浴滅酶5 min，冷卻后離心(4000 r/min，15 min)，取上清液定容于100 mL，分別用苯酚-硫酸法和Folin-酚法測A490和A640，計(jì)算酶解液中總糖和蛋白質(zhì)含量。選用酶解液中蛋白質(zhì)含量最高的蛋白酶A對原料液進(jìn)行一次酶解，總糖含量最高的蛋白酶B對一次酶解沉淀及超濾截留液進(jìn)行二次酶解。

1.3.3.2 酶解條件的優(yōu)化

對實(shí)驗(yàn)用酶進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，考察酶解時(shí)間、加酶量、酶解pH值和酶解溫度這4個(gè)因素。每個(gè)因素選取不同的水平，均做3次平行試驗(yàn)，計(jì)算酶解液中的總糖含量或蛋白質(zhì)含量。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，每個(gè)因素在最優(yōu)范圍內(nèi)選取3個(gè)水平，利用L9(34)正交試驗(yàn)表進(jìn)行正交試驗(yàn)，對每種實(shí)驗(yàn)用酶的酶解條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.3.3 雙酶體系復(fù)合酶解試驗(yàn)

提取海參多糖的關(guān)鍵在于破壞糖鏈與蛋白質(zhì)之間的共價(jià)結(jié)合，即肽鍵。由于蛋白酶對肽鏈斷裂作用具有專一性，一種酶只能水解固定的幾種氨基酸殘基，使其多糖提取率受到限制。因此，以單酶最佳酶解工藝為基礎(chǔ)，選用雙酶體系復(fù)合酶解，確定最佳酶解方案。

1.3.4 超濾條件的優(yōu)化

超濾過程中以不同的操作壓力、料液濃度和操作溫度為考察因素，以膜通量和膜效能為衡量指標(biāo)[21]，確定最佳超濾條件。膜通量以單位時(shí)間通過單位膜面積透過液的體積來表示，具體公式為：膜通量(LMH)=V/(T×S)；膜效能以單位時(shí)間通過單位膜面積透過液冷凍干燥后的質(zhì)量來表示，具體公式為：膜效能(MMH)=M/(T′×S)，其中，V為超濾透過液的體積(L)；M為超濾透過液冷凍干燥后的質(zhì)量(g)；S為平板超濾膜的表面積(m2)；T和T′為原料液通過膜表面所消耗的時(shí)間，單位分別為h和min。

1.3.5 超濾法分離分級海地瓜多肽和多糖

選用截留分子質(zhì)量為5 ku和1 ku的超濾膜依次對海地瓜多肽混合液進(jìn)行超濾分級，選用截留分子質(zhì)量為10，100和200 ku的超濾膜依次對海地瓜多糖粗提液進(jìn)行截留液超濾分級。采用截留液全循環(huán)超濾方式，當(dāng)截留液體積為原始酶解液體積的1/5時(shí)，達(dá)到超濾終點(diǎn)。依次收集5，1 ku截留液和1 ku透過液，透析除鹽并冷凍干燥得到3個(gè)海地瓜多肽組分。依次收集10，100，200 ku透過液和200 ku截留液，透析除鹽并冷凍干燥得到4個(gè)海地瓜粗多糖組分。

1.3.6 海地瓜高分子質(zhì)量粗多糖G4的離子交換柱層析法純化

參照文獻(xiàn)[22]，采用Q-Sepharose-Fast-Flow強(qiáng)陰離子交換柱對G4進(jìn)行分離純化。取適量海參粗多糖溶解、離心去沉淀后上樣，流速1 mL/min，每管收集5 mL，采用苯酚-硫酸法和波長280 nm處紫外吸收法分別測定各收集管的多糖含量和蛋白質(zhì)含量，繪制洗脫峰，按多糖峰收集各含糖組分，透析法(3500 u)除鹽、旋蒸濃縮、冷凍干燥后，低溫干燥儲藏備用。

1.3.7 羥基自由基(·OH)清除能力的測定

參照文獻(xiàn)[23-24]，反應(yīng)體系依次加入1.0 mL磷酸鹽緩沖液(pH =7.40，1 mol/L)、1.0 mL番紅花紅試劑(100 mg/L)、1.0 mL EDTA-Fe2+試劑(1 mmol/L)、0.5 mL各濃度樣品溶液以及1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)3% H2O2溶液，混合均勻，37 ℃下保溫靜置30 min，在波長520 nm處測吸光度值，記為AS(用1.0 mL磷酸鹽緩沖液加3.5 mL蒸餾水調(diào)零)。按照相同的操作方法，以1.5 mL蒸餾水代替樣品和H2O2溶液，吸光度值記為A；以0.5 mL蒸餾水代替樣品，吸光度值記為A0，·OH清除率計(jì)算公式為：·OH清除率(%) =(AS-A0)/A×100。

1.3.8 1,1-二苯基-苦肼基自由基(DPPH·)清除能力的測定

參照文獻(xiàn)[25-27]，取各濃度的樣品溶液2.0 mL和0.1 mmol/L的 DPPH·-乙醇溶液2.0 mL，充分混合均勻，在室溫下避光靜置30 min，在波長517 nm處測吸光度值，記為AS(用體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇調(diào)零)。按照相同的操作方法，以2.0 mL無水乙醇代替DPPH·-乙醇溶液，測吸光度值，記為A；以2.0 mL無水乙醇代替樣品溶液，測吸光度值，記為A0，DPPH·清除率計(jì)算公式為：DPPH·清除率(%)=( 1-(AS-A)/A0)×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解方法對海地瓜多肽和多糖提取率的影響

2.1.1 蛋白酶的篩選

由表1可以看出，從提取多肽的角度出發(fā)，胰蛋白酶的酶解效果最佳，可溶性蛋白質(zhì)含量明顯高于中性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解所得，且總糖含量最低，這可能是由于胰蛋白酶作為動物性蛋白酶對肽鍵斷裂作用專一性較高造成的。

從提取多糖的角度出發(fā)，作用譜廣的微生物酶中性蛋白酶的酶解效果最佳，酶解液中總糖含量最高，木瓜蛋白酶酶解能力稍弱。故選用胰蛋白酶對原料液進(jìn)行一次酶解，酶解條件參照文獻(xiàn)[28]。然后通過截留分子質(zhì)量10 ku的超濾膜分離得到分子質(zhì)量相對較小海地瓜多肽，提取率達(dá)到海地瓜體壁干質(zhì)量的(29.602±1.012)%，重復(fù)性好且純度較高，殘留糖含量控制在2%以下。

利用中性蛋白酶和木瓜蛋白酶對一次酶解沉淀及超濾截留液開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)，提取海地瓜粗多糖。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)。中性蛋白酶酶解條件為：pH值7.0，加酶量4%，酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間4 h。木瓜蛋白酶酶解條件為：酶解pH值7.0，加酶量4%，酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間4 h。改變其中一個(gè)條件，保持其他條件不變，分別考察不同影響因素對多糖提取率的影響。各因素取值范圍：酶解pH值為6.0，6.5，7.0，7.5，8.0；加酶量為1%，2%，4%，6%，8%；酶解溫度為40，50，60，70 ℃；酶解時(shí)間為2，4，6，8，10 h。

表1 最佳蛋白酶篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.2 酶解條件單因素試驗(yàn)

2.1.2.1 酶解時(shí)間對多糖提取率的影響

由圖1可以看出，隨著酶解時(shí)間延長，中性蛋白酶的多糖提取率逐漸增大，2～8 h之內(nèi)增大趨勢明顯，8 h之后趨于平緩。這是因?yàn)槿芤赫吵斫档兔阜肿拥囊苿有?，不利于酶解反?yīng)進(jìn)行，此時(shí)酶解產(chǎn)物達(dá)到飽和，阻礙多糖釋放。在2～8 h之內(nèi)，木瓜蛋白酶的多糖提取率同樣逐漸升高，8 h時(shí)提取率最高，之后有所降低。

2.1.2.2 加酶量對多糖提取率的影響

由圖2可以看出，隨著加酶量的增大，中性蛋白酶多糖提取率迅速上升， 6%時(shí)達(dá)到最大值，而后出現(xiàn)下降。這可能是因?yàn)殡S著加酶量的增大，酶解程度加深，酶解液粘度有所升高，部分多糖被各種雜質(zhì)吸附形成沉淀。木瓜蛋白酶多糖提取率隨加酶量的增大而增大，6%之后繼續(xù)增大加酶量，提取率增大幅度變小。因?yàn)榇藭r(shí)酶解已達(dá)到飽和，底物濃度不變，即使增大加酶量，沒有充足底物與酶結(jié)合，多糖提取率也不會有大幅度的增加。

2.1.2.3 酶解pH值對多糖提取率的影響

由圖3可以看出，酶解pH值對中性蛋白酶多糖提取率的影響程度很小，pH值在6.0～7.0內(nèi)，多糖提取率只有小幅度的升高，pH值在7.0以上時(shí)，多糖提取率幾乎沒有變化。酶解pH值對木瓜蛋白酶多糖提取率的影響則比較明顯，pH值在6.0～7.0內(nèi)，多糖提取率隨著pH值的增大而增大，pH值在7.0時(shí)多糖提取率達(dá)到最大，之后逐漸減小。因此，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的最佳酶解pH值均控制在7.0左右，這與酶制劑說明書的描述一致。

2.1.2.4 酶解溫度對多糖提取率的影響

由圖4可以看出，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的多糖提取率隨著溫度的升高均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。酶解溫度在50 ℃時(shí)，中性蛋白酶的多糖提取率最高；酶解溫度在60 ℃時(shí)，木瓜蛋白酶的多糖提取率最高。另外，由圖4還可以看出，酶解溫度對中性蛋白酶的影響程度更明顯。

2.1.3 酶解條件正交試驗(yàn)

2.1.3.1 中性蛋白酶正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)來考察中性蛋白酶酶解時(shí)間、加酶量、酶解pH值、酶解溫度4個(gè)因素對多糖提取率的影響，各因素水平見表2，正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。由表3可知，在各因素水平范圍內(nèi)，對中性蛋白酶多糖提取率的影響主次順序?yàn)椋杭用噶?酶解溫度>pH值>酶解時(shí)間。得到中性蛋白酶的最優(yōu)酶解條件A1B3C2D1：酶解時(shí)間為8 h，加酶量為7%，pH值為7.0，酶解溫度為45 ℃。在該條件下經(jīng)過3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到海地瓜體壁多糖提取率為體壁干重的(10.863±0.120)%。

表2 中性蛋白酶正交試驗(yàn)因素水平表

表3 中性蛋白酶正交試驗(yàn)結(jié)果

2.1.3.2 木瓜蛋白酶正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)考察木瓜蛋白酶酶解時(shí)間、加酶量、pH值、酶解溫度4個(gè)因素對多糖提取率的影響，各因素水平見表4，正交試驗(yàn)結(jié)果見表5。由表5可知，在各因素水平范圍內(nèi)，對木瓜蛋白酶多糖提取率的影響主次順序?yàn)椋杭用噶?pH值>酶解溫度>酶解時(shí)間，得到木瓜蛋白酶的最優(yōu)酶解條件A2B3C2D2：酶解時(shí)間為8 h，加酶量為8%，pH值為7.0，酶解溫度為60 ℃。在該條件下經(jīng)過3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到海地瓜體壁多糖提取率為體壁干質(zhì)量的(9.364±0.173)%。

表4 木瓜蛋白酶正交試驗(yàn)因素水平表

表5 木瓜蛋白酶正交試驗(yàn)結(jié)果

2.1.4 雙酶體系復(fù)合酶解試驗(yàn)

通過酶的篩選試驗(yàn)結(jié)果，本試驗(yàn)選擇多糖提取率較高的中性蛋白酶和木瓜蛋白酶，比較單酶酶解和雙酶復(fù)配使用對海地瓜多糖提取率的影響。由正交試驗(yàn)結(jié)果可以看出，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的最佳酶解pH值均為7.0。因此結(jié)合正交試驗(yàn)所得兩種單酶的最優(yōu)條件，在不同的組合方式下，僅改變酶解溫度和酶解時(shí)間，不同酶解的設(shè)計(jì)方案見表6。由表6可知，在酶解時(shí)間一定的情況下雙酶復(fù)配使用，無論是混合酶解還是分步酶解，均比單酶酶解效果好。這與不同蛋白酶底物特異性及活性中心不同有關(guān)，酶復(fù)配使用大大增加了其可酶解的底物范圍，多糖提取率明顯升高。而分步后酶解方案5和方案6的多糖提取率均比復(fù)合酶解型的高，這可能是因?yàn)閮煞N酶混合使用影響了各自的活性，而且無法同時(shí)兼顧兩種酶的最優(yōu)酶解條件。分步酶解兩種方案又以中性蛋白酶在先的效果更好，所以方案5為最佳酶解方案，即：先加入中性蛋白酶，在加酶量7%、酶解溫度45 ℃的條件下水解4 h，再加入木瓜蛋白酶，在加酶量8%、酶解溫度60 ℃的條件下水解4 h，整個(gè)過程pH值均為7.0，多糖提取率最高，達(dá)到了(14.511±0.162)%，重復(fù)性良好。

目前使用雙酶或多酶體系來提高多糖提取率的研究已有很多報(bào)道：展學(xué)孔等[29]采用胰蛋白酶和胃蛋白酶雙酶體系先后水解的方式提取海參多糖，本文研究結(jié)果與其一致，效果良好；冀利等[30]以濃縮棗汁超濾截留液為原料，選用植物蛋白酶、木瓜蛋白酶和酸性蛋白酶3種酶分步水解金絲小棗蛋白，提取了多糖和多肽。

表6 單酶與雙酶提取率比較

說明：A—中性蛋白酶，B—木瓜蛋白酶；Ⅰ型—單酶酶解，Ⅱ型—雙酶混合酶解，Ⅲ型—雙酶先后酶解

Notes：A—neutral proteinase;B—papain;I—single enzymolysis；Ⅱ—mixed enzymolysis;Ⅲ—mixed enzymes successively enzymolysis

2.2 海地瓜多肽和多糖的超濾法分離分級

2.2.1 超濾條件的優(yōu)化

2.2.1.1 操作壓力對超濾膜通量和膜效能的影響

在料液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%、操作溫度為25 ℃的條件下，研究不同操作壓力(0.10，0.15，0.20，0.25 MPa)對超濾膜通量和膜效能的影響，結(jié)果如圖5所示。由圖5可見，在0.10～0.25 MPa的壓力范圍內(nèi)，膜通量隨操作壓力升高而增加，當(dāng)其操作壓力上升到 0.20 MPa 以后，增加幅度趨于平緩。隨著壓力的增加，被截留的大分子物質(zhì)在膜表面不斷累積吸附，最終達(dá)到飽和形成凝膠層。此時(shí)，繼續(xù)增加壓力，除了增加能耗外，只會增加凝膠層的厚度、致密度和傳質(zhì)阻力，加重膜污染。因此，當(dāng)壓力達(dá)到0.20 MPa 以后，膜通量減緩，膜效能由增大變?yōu)闇p小。結(jié)合膜通量和膜效能兩項(xiàng)指標(biāo)綜合考慮，操作壓力選擇0.20 MPa為宜。

2.2.1.2 料液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對超濾膜通量和膜效能的影響

在操作壓力為0.20 MPa、操作溫度為25 ℃的情況下，研究不同料液質(zhì)量分?jǐn)?shù)(1%，2%，4%，6%，8%)對超濾膜通量和膜效能的影響，結(jié)果如圖6所示。由圖6可見，膜通量隨著料液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高而降低。這是因?yàn)榱弦吼ざ扰c溶質(zhì)濃度成正比，而粘度越高，擴(kuò)散系數(shù)越小，膜表面越易出現(xiàn)濃差極化現(xiàn)象，形成凝膠層，導(dǎo)致膜通量下降。但是低濃度料液中小分子溶質(zhì)含量少，膜效能很低，隨著料液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，膜效能顯著增大，質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到6%時(shí)膜效能增大幅度明顯減小。綜合考慮產(chǎn)品利用率、生產(chǎn)效率等，確定料液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%。

2.2.1.3 操作溫度對超濾膜通量和膜效能的影響

在操作壓力為0.20 MPa、料液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4 %的條件下，研究不同操作溫度(15，25，35，45 ℃)對超濾膜通量和膜效能的影響，結(jié)果如圖7所示。由圖7可見，溫度升高，膜通量和膜效能都隨之增大。這是因?yàn)榱弦吼ざ入S溫度上升而下降，因而擴(kuò)散系數(shù)增加，濃差極化影響降低，有效延緩了膜表面凝膠層的形成。但是，溫度升高使蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)體積膨脹而結(jié)構(gòu)變得疏松不規(guī)則，易造成堵塞污染或吸附污染。當(dāng)溫度升高到35 ℃時(shí)，膜效能增加幅度明顯降低。綜合考慮膜通量和膜效能大小及經(jīng)濟(jì)效益，本實(shí)驗(yàn)采用35 ℃作為超濾溫度。

2.2.2 海地瓜多肽和多糖的超濾分離分級

超濾分級得到3個(gè)不同分子質(zhì)量段5～10 ku、1～5 ku和<1 ku的海地瓜多肽，分別命名為P1、P2和P3。經(jīng)測定各組分中多肽含量，計(jì)算得到不同分子質(zhì)量段海地瓜多肽在海地瓜多肽混合液中所占比例：P1(48.47%)，P2(18.46%)，P3(33.07%)。

超濾得到4個(gè)不同分子質(zhì)量段(<10 ku，10～100 ku，100～200 ku，>200 ku)的海地瓜多糖，分別命名為G1、G2、G3和G4，測定4個(gè)組分中的化學(xué)組成如表7。由表7可見，隨著分子質(zhì)量的增大，海地瓜粗多糖中總糖含量逐漸增加，蛋白質(zhì)含量逐漸減少，分子質(zhì)量大于200 ku的粗多糖G4中總糖含量已升至55.99%，蛋白質(zhì)含量已降至6.33%。故本研究只對所占比例較高且雜質(zhì)最少的粗多糖G4進(jìn)一步分級純化。

表7 海地瓜多糖的化學(xué)組成

2.2.3 粗多糖G4的離子交換柱層析法純化

樣品經(jīng)初始Tris-HCl緩沖液(含0 mol/L NaCl)洗脫和0～4 mol/L NaCl線性洗脫后，選擇了NaCl濃度為0，0.5，1.0，1.5，2.0 mol/L的洗脫鹽對海地瓜多糖G4進(jìn)行等梯度洗脫，洗脫峰如圖8所示。由圖8分析確定NaCl洗脫鹽濃度為0，0.5，1.5 mol/L，洗脫出現(xiàn)3個(gè)主要的多糖峰，洗脫濃度的增大說明多糖組分中與凝膠發(fā)生離子交換作用的物質(zhì)逐漸增多，可以推測最后一種多糖中含有最多的酸根離子。另外，由圖8還可以看出，多糖峰二與蛋白質(zhì)檢測峰重合，推測其成分可能為糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物。多糖峰三無蛋白質(zhì)檢出，推測可能是一種組分單一的多糖。合并收集粗多糖洗脫曲線三個(gè)峰值處的多糖組分，經(jīng)除鹽、濃縮、冷凍干燥處理后，低溫干燥環(huán)境中儲藏，得到海地瓜多糖呈乳白色棉絮狀，分別命名為G4-1、 G4-2和 G4-3。G4經(jīng)過離子交換柱分離純化得到的3種純多糖的化學(xué)組成差異很大，說明相同分子質(zhì)量范圍內(nèi)存在不同的多糖的組分，可以通過柱層析的方法分離。柱層析純化多糖G4-1、G4-2、G4-3的化學(xué)組成如表7，其中G4-2蛋白質(zhì)含量較高，占21.98%，進(jìn)一步驗(yàn)證了G4-2洗脫過程中出現(xiàn)蛋白峰的原因，即G4-2是一種糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物。G4-3中幾乎不含蛋白質(zhì)，硫酸根和巖藻糖含量很高，說明G4-3是高度硫酸酯化的巖藻聚糖。而G4-1中巖藻糖含量最高，達(dá)到43.98%，氨基己糖、葡萄糖醛酸及硫酸根含量最低，說明G4-1是一種純度較高的同多糖，這也是G4-1能被不含NaCl的洗脫液最先洗脫下來的原因。

2.3 海地瓜多肽和多糖的抗氧化活性

2.3.1 清除羥基自由基(·OH)的能力

由圖9～圖11可以看出，海地瓜多肽、粗多糖和純化多糖的·OH清除能力均隨著質(zhì)量濃度的增大顯著增強(qiáng)，且均高于Vc。不同分子質(zhì)量段海地瓜多肽的·OH清除能力隨著分子質(zhì)量的增大而降低，且差異較顯著，分子質(zhì)量最小P3對·OH的清除能力最強(qiáng)。不同分子質(zhì)量段粗多糖中，G4的清除能力最強(qiáng)，質(zhì)量濃度在6 g/L時(shí)·OH清除率已達(dá)到(98.42±1.89)%。3種海地瓜純化多糖中，G4-1的·OH清除能力最強(qiáng)。

2.3.2 清除1,1-二苯基-苦肼基自由基(DPPH·)的能力

由圖12可以看出，Vc在較低的質(zhì)量濃度下表現(xiàn)出很強(qiáng)的DPPH·清除能力，而且隨質(zhì)量濃度增加，增幅較大。對比圖13—圖15可以看出，海地瓜多肽、粗多糖和純化多糖組分的DPPH·清除能力均隨質(zhì)量濃度升高而增強(qiáng)，但是均低于Vc。海地瓜不同分子質(zhì)量段多肽中，P2的DPPH·清除能力最強(qiáng)，在1～4 g/L范圍內(nèi)清除率迅速增大，之后保持很小幅度緩慢增大。海地瓜粗多糖中，G4在低質(zhì)量濃度時(shí)表現(xiàn)出的DPPH·清除能力較弱，2～4 g/L范圍內(nèi)DPPH·清除率迅速升高，從(24.02±1.22)% 增至(79.11±1.72)%，之后一直保持最強(qiáng)的DPPH·清除能力。3種海地瓜純化多糖中，G4-2的DPPH·清除能力最強(qiáng)，且在較低質(zhì)量濃度1 g/L時(shí)，DPPH·清除率已達(dá)到(42.56±1.04)%，但增長趨勢相對比較平緩。與·OH清除能力類似，G4-3的DPPH·清除能力最弱。

3 結(jié)論

1)本實(shí)驗(yàn)中選用胰蛋白酶對海地瓜體壁干粉進(jìn)行一次酶解，在料液比(m/V)1∶40、加酶量2.4%、 pH 7.5、酶解溫度45 ℃的條件下酶解8 h。然后通過截留分子質(zhì)量10 ku的超濾膜分離得到海地瓜多肽，提取率達(dá)到(29.602±1.012)%。選用中性蛋白酶和木瓜蛋白酶復(fù)合使用進(jìn)行二次酶解：先加入7%的中性蛋白酶，45 ℃酶解溫度下酶解4 h；再加入8%的木瓜蛋白酶，60 ℃酶解溫度下酶解4 h，整個(gè)過程pH值均為7.0，多糖提取率達(dá)到(14.511±0.162)%。

2)本實(shí)驗(yàn)中得到的最佳超濾條件為：操作壓力為0.20 MPa，料液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%，操作溫度為35 ℃。按照從大分子質(zhì)量到小分子質(zhì)量的順序?qū)５毓隙嚯倪M(jìn)行超濾分級，得到3個(gè)不同分子質(zhì)量段的海地瓜多肽： P1(5～10 ku，48.47%)，P2(1～5 ku，18.46%)，P3(<1 ku，33.07%)。按照從小分子質(zhì)量到大分子質(zhì)量的順序?qū)５毓隙嗵沁M(jìn)行超濾分級，得到4個(gè)不同分子質(zhì)量段的海地瓜粗多糖： G1(<10 ku，63.09%)，G2(10～100 ku，7.24%)，G3(100～200 ku，4.67%)，G4(>200 ku，25.00%)。

3)采用Q-Sepharose-Fast-Flow陰離子交換柱層析法對G4進(jìn)行純化，在0，0.5，1.5 mol/L洗脫鹽濃度下，得到3種多糖組分G4-1、 G4-2和 G4-3。透析除鹽、冷凍干燥得到乳白色棉絮狀多糖樣品。

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