付朋 岑泳村 黃琴 趙洪洋 項(xiàng)煒*

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院: 1神經(jīng)外科; 2康復(fù)科，湖北 武漢 430022)

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma, GBM)為成年人最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤中惡性程度最高、預(yù)后最差的腫瘤[1]。腦膠質(zhì)瘤的重要特征在于其血管增生程度[2]。腫瘤的血管依賴于分化抗原簇31(cluster of differentiation 31, CD31)陽(yáng)性的內(nèi)皮細(xì)胞的增殖分裂，擴(kuò)展延長(zhǎng)，內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的血管共同為膠質(zhì)瘤細(xì)胞向鄰近腦組織的外遷與侵襲提供橋梁[3]。大量研究表明血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial cell growth factor, VEGF)廣泛參與腦膠質(zhì)瘤血管擬態(tài)的發(fā)生發(fā)展，但最早研發(fā)抗腫瘤血管中針對(duì)VEGF-A作用的貝伐單抗阿伐斯丁(Avastin)在臨床試驗(yàn)結(jié)果中顯示治療效果欠佳[4]。同時(shí)，研究結(jié)果表明多種腫瘤中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子C及其受體3(vascular endothelial cell growth factor C/vascular endothelial cell growth factor receptor 3, VEGF-C/VEGFR-3)軸能夠促進(jìn)腫瘤血管的增殖與遷移[5-6]。而關(guān)于人腦膠質(zhì)瘤中很少對(duì)VEGF-C/VEGFR-3的研究。本文旨在了解VEGFR-3在人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)，初步了解其參與人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤血管擬態(tài)作用，探討其作為新的抗腫瘤血管治療靶點(diǎn)的可能。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)于2014年6月至2015年8月在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室完成。所用人腦膠質(zhì)瘤新鮮腫瘤組織來源于武漢協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)切除標(biāo)本，以上均征得患者家屬知情同意。術(shù)后新鮮腫瘤標(biāo)本行病理檢查并根據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO)神經(jīng)上皮組織腫瘤分級(jí)證實(shí)為WHO IV級(jí)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。

二、內(nèi)皮細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

1.細(xì)胞的提?。喝⌒迈r手術(shù)腫瘤標(biāo)本除去血塊，血管及電灼和壞死組織。磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer solution, PBS)漂洗2次去除血液殘留；將腫瘤組織剪成1 mm×1 mm瘤塊，加入0.25%胰蛋白酶中，置于37 ℃電磁恒溫?cái)嚢杵魃舷? h，細(xì)胞懸液經(jīng)70 μm的濾網(wǎng)過濾；在離心機(jī)轉(zhuǎn)速1 500 r/min上離心5 min，棄上清并小心使用PBS洗滌沉淀兩次除去殘留胰酶，用5 mL含0.1%牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)的PBS重懸成單細(xì)胞懸液。

2.免疫磁珠分選：將CD31抗體(ABCM公司)4 μL與M-450免疫磁珠(Dynal公司)40 μL預(yù)先與0.1%BSA的PBS 4 mL混合震蕩過夜，并洗脫未結(jié)合抗體后備用。將細(xì)胞細(xì)胞懸液與抗體CD31標(biāo)記了的免疫磁珠液相混合；搖床4 ℃輕搖10 min，分離器中分離所得陽(yáng)性細(xì)胞，用含0.1% BSA的PBS反復(fù)重懸和磁分離，如此反復(fù)進(jìn)行3次后，將細(xì)胞重懸內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(LONZA公司, EBM-2 Basal Medium 500 mL)，計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞密度5×103個(gè)/mL并培養(yǎng)在10 cm培養(yǎng)瓶中。

3.細(xì)胞體外傳代培養(yǎng)： CD31陽(yáng)性內(nèi)皮細(xì)胞為貼壁細(xì)胞。 細(xì)胞培養(yǎng)在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中，根據(jù)細(xì)胞的接種數(shù)目、生長(zhǎng)速度每3～4 d換液，貼壁在70%～80%時(shí)消化傳代，用0.25%不含乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA)胰酶消化2 min，顯微鏡下觀察見大部分細(xì)胞脫落后，培養(yǎng)基輕吹打終止消化離心，棄上清，重懸傳代。

三、腦膠質(zhì)瘤組織染色

取新鮮的人腦膠質(zhì)瘤腫瘤組織，用10%福爾馬林固定后常規(guī)脫水處理并石蠟包埋。切片機(jī)上制取石蠟切片，每張切片厚度控制在10 μm。切片經(jīng)脫蠟，水化；使用3%過氧化氫室溫孵育消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。用熱修復(fù)法進(jìn)行抗原修復(fù)暴露抗原決定簇；5%正常山羊血清(PBS稀釋)封閉，室溫孵育，加入適當(dāng)比例一抗4 ℃條件下孵育過夜。加入適當(dāng)稀釋比例的生物素標(biāo)記二抗孵育后；洗滌加入辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素37 ℃孵育；二氨基聯(lián)苯胺(diaminobebzidine, DAB)顯色，蒸餾水充分沖洗，復(fù)染，脫水透明后封片。顯微鏡下觀察拍片。

四、酶聯(lián)免疫吸附法

取經(jīng)培養(yǎng)3 d后所得膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87、U251的細(xì)胞培養(yǎng)液，用酶聯(lián)免疫試劑盒測(cè)定。一抗包埋96孔板后4 ℃孵育過夜，加入待測(cè)培養(yǎng)液100 μL每孔至96孔板中后室溫溫孵育1 h。沖洗之后，加入檢測(cè)抗體(生物素標(biāo)記)每孔100 μL，室溫下放置1 h后沖洗；加入100 μL酶結(jié)合工作液并避光孵育1 h沖洗后；加入100 μL顯色底物液孵育20 min后終止。最后在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)量OD值。設(shè)空白對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。

五、實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

使用Trizol法提取人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞和組織中RNA，最后加上0.01%焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate, DEPC)水20 μL備用。人VEGFR-3上游引物：5'-AGAG GAACCAGGAGGACAAG-3'；下游引物：5'-CAGGTGCT GAAGGACATT-3'(330 bp)；內(nèi)參人β-actin上游引物：5'-ATCATGTTTGAGACCTTCAA-3'；下游引物：5'-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3'。PCR產(chǎn)物電泳、圖像分析：取所得產(chǎn)物15 μL上樣量在3%瓊脂糖凝膠上電泳，60 V電壓，15 min，2 h后圖像分析鑒定。

六、血管成形功能測(cè)定

μ型孔板鋪板：預(yù)先加入IV型膠原(Collagen IV)10 μL/孔，置37 ℃溫箱中孵育1 h備用。制備懸浮細(xì)胞：取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)良好的膠質(zhì)瘤內(nèi)皮細(xì)胞，棄培養(yǎng)基，PBS沖洗；用0.25%不含EDTA胰酶消化1～2 min至細(xì)胞懸浮加培養(yǎng)基終止消化，離心1 000 r/min，5 min；棄上清，培養(yǎng)基按照每孔5×105個(gè)細(xì)胞/50 μL的濃度分對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組兩管懸??；其中對(duì)照組未任何處理，實(shí)驗(yàn)組中按所懸浮液體積加入一定比例MAZ51吹打混勻(確保工作液中MAZ51濃度為7 μM)，每孔50 μL體積植入預(yù)先備好的μ型孔板。培養(yǎng)及功能檢測(cè)：將接種好的細(xì)胞板在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后顯微鏡下觀察拍片并使用軟件分析不同實(shí)驗(yàn)控制因素下血管成形的功能。

七、劃痕實(shí)驗(yàn)

用6孔板培養(yǎng)細(xì)胞做劃痕實(shí)驗(yàn)，預(yù)先用記號(hào)筆在6孔板背后均勻劃出約間隔0.5 cm的橫穿過孔直線，每孔至少劃5條線。取處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，棄培養(yǎng)液，PBS沖洗，加入用0.25%不含EDTA胰酶消化至細(xì)胞懸浮，培養(yǎng)基終止消化，1 000 r/min，5 min；棄上清，培養(yǎng)基重懸為單個(gè)細(xì)胞并計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)；調(diào)節(jié)密度為約5×105個(gè)細(xì)胞/mL的濃度并分對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組兩管；對(duì)照組未任何處理，實(shí)驗(yàn)組中加入MAZ51與細(xì)胞懸液吹打混勻(確保工作液中MAZ51濃度為7 μM)然后各向每孔加入1.5 mL細(xì)胞懸液。置于37 ℃，5% CO2溫箱培養(yǎng)24 h后，用200 μL槍頭在板底孔內(nèi)作垂直于記號(hào)線劃痕，使劃痕線部位細(xì)胞脫落形成傷口；PBS沖洗3次，洗去脫落細(xì)胞，換液(其中實(shí)驗(yàn)組中為配置好的7 μM的MAZ51的工作液)，記此時(shí)為0 h；并于24 h后進(jìn)行拍照觀察記錄每一劃痕和標(biāo)記線交匯處的傷口寬度。

八、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞準(zhǔn)備：取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，棄培養(yǎng)液，PBS沖洗；胰酶消化，培養(yǎng)基終止；1 000 r/min，5 min；棄上清，培養(yǎng)基重懸為單個(gè)細(xì)胞并取樣計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。從而計(jì)算細(xì)胞懸液濃度并求出存活與死亡細(xì)胞數(shù)的比例，記錄種板前實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的活細(xì)胞數(shù)量。然后各向每個(gè)6孔板加入1.5 mL/孔細(xì)胞懸液，其中對(duì)照組的培養(yǎng)基未任何處理，實(shí)驗(yàn)組中加入MAZ51與細(xì)胞懸液吹打混勻(確保工作液中MAZ51濃度為7 μM)。置于37 ℃，5% CO2溫箱培養(yǎng)24 h。24 h后將兩組細(xì)胞重新消化細(xì)胞，并用同樣方法再次計(jì)數(shù)。為控制實(shí)驗(yàn)最后計(jì)數(shù)誤差，相同條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)分析。

結(jié) 果

一、VEGF-C在人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織和細(xì)胞系中的表達(dá)

為明確VEGF-C在惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的表達(dá)，我們從人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織和膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87中提取RNA，利用RT-PCR進(jìn)行測(cè)定。如圖1B示人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U-87中，及人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中均表達(dá)VEGF-A、VEGF-C、 VEGF-D；使用ELISA方法進(jìn)一步測(cè)定膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87、U251培養(yǎng)液中VEGF-C的分泌情況，如圖1C示在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251、U87中VEGF-C都有表達(dá)的存在，但有量的差異。

二、VEGFR-3在人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)

為了解VEGF-C對(duì)應(yīng)的受體VEGFR-3在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)，本文使用免疫組化技術(shù)顯示人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織標(biāo)本中VEGFR-3的表達(dá)。圖2A中HE染色標(biāo)本中可見人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中細(xì)胞增生明顯。相對(duì)圖2B陰性對(duì)照，圖2C中可見膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中CD31陽(yáng)性表達(dá)血管內(nèi)皮細(xì)胞提示腫瘤血管增生。圖2D示VEGFR-3在人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中廣泛陽(yáng)性表達(dá)，不僅表達(dá)腫瘤間質(zhì)中細(xì)胞，而且表達(dá)于腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞中(如圖2中箭頭所示)。

三、VEGFR-3在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)

為明確VEGFR-3在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)將腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞使用磁珠分離法成功分離出CD31陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞并成功進(jìn)行體外培養(yǎng)。進(jìn)一步使用RT-PCR和免疫組化技術(shù)顯示VEGFR-3在血管內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá)，如圖3、4所示，在基因水平和分子水平均可見人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞中VEGFR-3陽(yáng)性表達(dá)。

圖1 VEGF-C在人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織和細(xì)胞系中的表達(dá)

Fig 1 The expression of VEGFR-C in human glioblastoma tissues and cell lines

A: The treatment of glioma with Avastin was achieved by blocking the receptor sites of VEGF-A and the expression of VEGF-C/VEGFR-3 in human gliomas lead to the bad performance of Avastin; B: The expression of VEGF-A, VEGF-C and VEGF-D in human glioma cell line U87 and human glioblastomas was detected by RT-PCR; C: Different secretion of VEGF-C in cell lines U251 and U87 was detected by ELISA.

圖2 VEGFR-3在人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中的表達(dá) (A: HE染色；B～D：DAB染色，×200)

Fig 2 The expression of VEGFR-3 in human glioblastoma tissues (A: HE; B～D: DAB，×200)

A: Glioblastoma tissues showed significant proliferation of cancer cells (HE); B: Negative control; C: CD31 positive expression of vascular endothelial cells; D: VEGFR-3 was widely expressed in human glioblastoma tissues and endothelial cells (IHC-P). Bar=50 μL.

圖3 VEGFR-3在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)

Fig 3 The expression of VEGFR-3 in human glioblastoma vascular endothelial cells by RT-PCR

圖4 VEGFR-3在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá) (HE, ×200)

Fig 4 The expression of VEGFR-3 in human glioblastoma vascular endothelial cells by immunohistochemistry (HE, ×200) Bar=50 μL.

四、VEGFR-3對(duì)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷徙和血管成形能力的作用

為明確VEGFR-3在人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤腫瘤血管擬態(tài)中的作用，本實(shí)驗(yàn)在體外使用VEGFR-3特異性抑制劑MAZ51分別測(cè)試其對(duì)人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管成形能力(圖5A)、遷徙能力(圖5B)和增殖(5C)。如圖所示，7 μM的MAZ51可以明顯抑制腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管成形、遷徙和增殖能力。

圖5 VEGFR-3對(duì)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷徙和血管成形能力的作用

Fig 5 Effect of VEGFR-3 on proliferation migration and formation of tumor vascular endothelial cells

A: VEGFR-3 with specific inhibitor MAZ51 could influence the proliferation of tumor vascular endothelial cells; B: VEGFR-3 with specific inhibitor MAZ51 could influence the migration of tumor vascular endothelial cells; C: VEGFR-3 with specific inhibitor MAZ51 could influence the tube formation ability of tumor vascular endothelial cells.

aP<0.05;bP<0.05,vscontrol group.

討 論

血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子為分泌性的糖蛋白，可以分為VEGF-A、PGF、VEGF-B、VEGF-C、BEGF-A五個(gè)亞型，其中VEGF-A已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)廣泛表達(dá)于人腦膠質(zhì)瘤并參與其發(fā)生發(fā)展的多個(gè)環(huán)節(jié)[4]。但是針對(duì)VEGF-A的單抗阿伐斯丁在人腦膠質(zhì)瘤臨床試驗(yàn)結(jié)果中顯示療效欠佳[5]，而其他亞型在人腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)和作用仍有待進(jìn)一步研究。研究表明VEGF-C/VEGFR-3同樣廣泛表達(dá)于人類腫瘤細(xì)胞和淋巴內(nèi)皮細(xì)胞中，VEGF-C/VEGFR-3高表達(dá)和腫瘤的增殖與遷移密切相關(guān)，如圖1A所示[6-8]。

本實(shí)驗(yàn)初步研究證實(shí)VEGF-C人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中廣泛表達(dá)，同時(shí)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87、U251均有表達(dá)，在U251細(xì)胞中VEGF-C的表達(dá)含量較U87表達(dá)量稍低，文獻(xiàn)顯示VEGF-C的高表達(dá)和人腦膠質(zhì)瘤的預(yù)后不良相關(guān)[9]。我們的研究結(jié)果顯示VEGFR-3廣泛表達(dá)于膠質(zhì)瘤間質(zhì)中，同時(shí)其還表達(dá)于腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞上。符合了VEGFR-3的表達(dá)和腦膠質(zhì)瘤的級(jí)別呈正相關(guān)的報(bào)道[10]，我們?cè)诨蛩胶头肿铀阶C實(shí)了人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤分離所得的內(nèi)皮細(xì)胞上VEGFR-3的陽(yáng)性表達(dá)，為進(jìn)一步研究VEGFR-3對(duì)該腫瘤發(fā)生發(fā)展提供了基礎(chǔ)。

為進(jìn)一步明確在腦膠質(zhì)瘤血管擬態(tài)中VEGF-C/VEGFR-3的作用，我們使用VEGFR-3特異性阻滯劑MAZ51，結(jié)果顯示MAZ51能有效降低腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞的侵襲，增殖和血管成形能力。關(guān)于具體的作用機(jī)制目前報(bào)道不一。在研究口腔鱗狀癌細(xì)胞中顯示MAZ51可抑制影響淋巴血管的形成和影響腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞；MAZ51的抑制作用呈現(xiàn)劑量和暴露時(shí)間依賴性，非細(xì)胞毒性劑量能通過作用VEGF-C/VEGFR-3結(jié)合體抑制細(xì)胞的增殖和遷徙能力[11]。

總之，本課題證實(shí)了VEGF-C在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中表達(dá)，同時(shí)其對(duì)應(yīng)的VEGFR-3在腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)，并在體外實(shí)驗(yàn)中使用VEGFR-3特異性抑制劑MAZ51證實(shí)了其可以抑制腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，遷徙和血管成形能力，以上結(jié)果證實(shí)了VEGF-C/VEGFR-3參與人腦膠質(zhì)瘤血管擬態(tài)的發(fā)生發(fā)展，同時(shí)提示了VEGF-C/VEGFR-3有可能成為人腦膠質(zhì)瘤抗血管治療新的靶點(diǎn)。

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