冉冬旭 歐 瑤 劉榮鵬 肖海梅 徐漢福

(家蠶基因組生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，重慶 400715)

家蠶以高效合成和分泌蠶絲蛋白著稱，蠶絲蛋白作為一種純天然的高分子材料，不僅力學(xué)性能優(yōu)良，還具有優(yōu)異的組織相容性、生物可降解性、環(huán)境穩(wěn)定性以及一定的抗菌功能，這些優(yōu)良特性使其在醫(yī)藥、食品、組織工程、日用精細(xì)化工等領(lǐng)域備受關(guān)注[1-2]，相關(guān)研究和開發(fā)十分活躍。

抗菌是蠶絲蛋白的一個(gè)重要特性，該特性對(duì)于生物醫(yī)學(xué)材料開發(fā)等具有重要意義，但天然蠶絲蛋白的抗菌功效尚難達(dá)到生物醫(yī)學(xué)材料開發(fā)的應(yīng)用實(shí)際需求。為解決該問題，國(guó)內(nèi)外學(xué)者開發(fā)了多種策略，如：利用化學(xué)鍍工藝處理蠶絲材料，在蠶絲材料中添加納米銀，在蠶絲材料中添加抗菌肽等[3-7]。這些方法盡管有助于提高蠶絲的抗菌性能，但離實(shí)際應(yīng)用仍有一定距離。此外，添加金屬離子等方法對(duì)人體健康和環(huán)境也存在不良影響[8]。因此，有必要探索提高蠶絲抗菌性能的新策略。

殺菌/通透性增加蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein，BPI)是Weiss等人最先在人類中性粒細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種相對(duì)分子量為56 kDa的陽(yáng)離子抗菌蛋白，具有強(qiáng)大的殺滅革蘭氏陰性菌及中和內(nèi)毒素的能力，同時(shí)還有調(diào)節(jié)免疫、抑制血管生成、抗真菌和殺滅寄生蟲等作用，譽(yù)有“超級(jí)抗生素”之稱[9-10]。近年研究證實(shí)，人源BPI蛋白的N末端區(qū)富含陽(yáng)離子氨基酸和親水殘基，利用原核和真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的相對(duì)分子量為23 kDa的N末端氨基酸片段(hBPI23)與天然人BPI具有完全相同的生物學(xué)作用[11-16]，表明hBPI23是開發(fā)抗菌藥物和提高抗菌功效的一個(gè)理想分子靶標(biāo)。本研究以hBPI23為靶標(biāo)，制作獲得在后部絲腺特異表達(dá)hBPI23的轉(zhuǎn)基因蠶，以期為探索利用hBPI23提高蠶絲的抗菌性能打下素材基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試家蠶品系Nistari，為多化性品系，由本實(shí)驗(yàn)室保存。亞克隆載體p57S[fibH-MCS-LBS]、piggyBac骨架載體pBac[3×P3EGFPafm]和輔助質(zhì)粒A4 Helper均由本課題組構(gòu)建或保存。注射用超純質(zhì)粒DNA采用QIAprep Spin Miniprep試劑盒(購(gòu)自QIAGEN公司)制備。

1.2 基因合成和載體構(gòu)建

以人BPI蛋白的N端序列(hBPI23)為基礎(chǔ)，根據(jù)家蠶密碼子偏好進(jìn)行優(yōu)化后由南京金斯瑞生物科技有限公司直接合成，序列兩端分別為BamHI和NotI酶切位點(diǎn)，并在C末端加6×His標(biāo)簽序列。采用BamHI和NotI雙酶切hBPI23合成質(zhì)粒并回收目的片段，裝到經(jīng)同樣酶切的亞克隆載體p57S[fibH-MCS-LBS]中，構(gòu)建獲得p57S[fibH-hBPI23-LBS]。利用AscI單酶切p57S[fibH-hBPI23-LBS]質(zhì)粒，將回收的目的片段與經(jīng)同樣酶切的pBac[3×P3EGFPafm]骨架載體連接，構(gòu)建獲得最終表達(dá)載體pB[fibH-hBPI23-LBS,3×P3EGFP]。表達(dá)載體質(zhì)粒測(cè)序由深圳華大基因科技股份有限公司完成。

1.3 顯微注射和熒光篩選

將制備的pB[fibH-hBPI23-LBS,3×P3EGFP]和A4 Helper超純質(zhì)粒DNA按1∶1摩爾比混合，顯微注射到產(chǎn)卵后1～3 h的Nistari早期胚胎(G0代)。G0代孵化幼蟲飼育至羽化后進(jìn)行自交或回交制種，獲得的G1代蠶卵于點(diǎn)青期前1d左右置于體視熒光顯微鏡(Olympus，日本)下檢測(cè)，篩選在胚胎眼睛或神經(jīng)組織發(fā)熒光的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性個(gè)體，并以蛾圈為單位單獨(dú)飼育。

1.4 基因組整合位點(diǎn)分析

提取野生型Nistari(WT，下同)蠶蛾和G1代陽(yáng)性蠶蛾基因組DNA，采用HaeIII內(nèi)切酶酶切消化3～4 h，然后用T4 DNA連接酶進(jìn)行環(huán)化連接。以連接產(chǎn)物為模板，分別利用piggyBac轉(zhuǎn)座子的左臂和右臂特異引物進(jìn)行Inverse PCR擴(kuò)增。piggyBac左臂引物序列為5’-ATCAGTGACACTTACCGCATTGACA-3’和5’-TGACGAGCTTGTTGGTGAGGATTCT-3’;piggyBac右臂引物序列為5’-TACGCATGATTATCTTTAACGTA-3’和5’-GGGGTCCGTCAAAACAAAACATC-3’。膠回收Inverse PCR目的片段并進(jìn)行T克隆，然后送公司測(cè)序。測(cè)序序列利用SilkDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.silkdb.org/silkdb/)中的BLAST和SilkMap程序進(jìn)行比對(duì)和染色體定位分析。

1.5 轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析

利用Total RNA Kit II(Omega, 美國(guó))試劑盒分別提取WT和G1代陽(yáng)性蠶蛾，以及5齡第1d至第6d的WT和G2代轉(zhuǎn)基因幼蟲后部絲腺總RNA，反轉(zhuǎn)錄后制備成cDNA模板。蠶蛾cDNA用于RT-PCR檢測(cè)，后部絲腺cDNA用于qRT-PCR檢測(cè)。PCR引物序列包括：hBPI23特異引物5’-ATGGCTCGTGGTCCCTGTA-3’和5’-GCTGCTGTGCCCTGTTGA-3’(目的片段大小為152 bp)；BmActin3檢測(cè)引物5’-AACACCCCGTCCTGCTCACTG-3’和5’-GGGCGAGACGTGTGATTTCCT-3’；qRT-PCR內(nèi)參基因(BmeIF4A)檢測(cè)引物5’-TTCGTACTGGCTCTTCTCGT-3’和5’-CAAAGTTGATAGCAATTCCCT-3’。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2 結(jié)果與分析

2.1 H-hBPI23轉(zhuǎn)基因系的制作

以合成的hBPI23序列為基礎(chǔ)，采用酶切連接方式將其組裝到piggyBac骨架載體pBac[3×P3EGFPafm]中，構(gòu)建成最終表達(dá)載體pB[fibH-hBPI23-LBS,3×P3EGFP](圖1)。將制備的pB[fibH-hBPI23-LBS,3×P3EGFP]超純質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒等摩爾比混合后，顯微注射至Nistari早期胚胎(G0代)，于次代(G1代)胚胎期第7d進(jìn)行熒光觀察，在16個(gè)G1代蛾圈中篩選獲得了1個(gè)陽(yáng)性蛾圈，將其命名為H-hBPI23(圖2)。

圖1 pB[fibH-hBPI23-LBS,3×P3EGFP]表達(dá)載體示意圖

圖2 G1代H-hBPI23轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性個(gè)體

2.2 H-hBPI23的基因組整合位點(diǎn)

以G1代H-hBPI23轉(zhuǎn)基因蠶蛾的基因組DNA為模板，利用Inverse PCR技術(shù)對(duì)H-hBPI23基因組整合位點(diǎn)的兩翼序列進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序分析，結(jié)果顯示，H-hBPI23的基因組整合位點(diǎn)位于家蠶第23號(hào)染色體上的nscaf3027，以單拷貝形式存在(圖3)。

2.3 hBPI23的轉(zhuǎn)錄表達(dá)特征

以G1代H-hBPI23蠶蛾cDNA為模板，利用hBPI23特異引物進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示：僅在H-hBPI23個(gè)體中擴(kuò)增出了與預(yù)期大小一致的目的條帶，表明在轉(zhuǎn)基因個(gè)體中hBPI23能夠轉(zhuǎn)錄表達(dá)(圖4)。隨后，以5齡第1d至第6d的G2代H-hBPI23幼蟲后部絲腺cDNA為模板，利用hBPI23特異引物進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，結(jié)果圖5所示：在H-hBPI23幼蟲后部絲腺中，hBPI23在5齡第1d和第2d有微弱表達(dá)，5齡第3d開始大量表達(dá)，5齡第6d(吐絲前1d)達(dá)到表達(dá)峰值，其表達(dá)模式與家蠶內(nèi)源絲素蛋白基因類似。

圖3 H-hBPI23的基因組整合位點(diǎn)

圖4 H-hBPI23蠶蛾中hBPI23的表達(dá)檢測(cè)

圖5 H-hBPI23幼蟲后部絲腺中hBPI23的表達(dá)特征

3 討論

天然蠶絲蛋白具有一定的抗菌性能，但從生物醫(yī)學(xué)材料等應(yīng)用開發(fā)要求來(lái)看，其抗菌活性還有待進(jìn)一步提高。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者探索建立了添加納米銀離子、化學(xué)鍍處理等多種提高蠶絲蛋白抗菌活性的有效方法，但這些方法對(duì)環(huán)境或人體健康也帶來(lái)了潛在的風(fēng)險(xiǎn)，尚需進(jìn)一步改進(jìn)。本研究以具有強(qiáng)大殺滅革蘭氏陰性菌及中和內(nèi)毒素能力的人BPI蛋白的N末端氨基酸片段(hBPI23)為靶標(biāo)，首先根據(jù)家蠶密碼子偏好合成了hBPI23序列，進(jìn)而通過(guò)顯微注射制作獲得了轉(zhuǎn)基因系H-hBPI23。分子檢測(cè)證實(shí)，hBPI23在轉(zhuǎn)基因家蠶后部絲腺中高量轉(zhuǎn)錄表達(dá)，在5齡第6d(吐絲前1d)達(dá)到表達(dá)高峰，表明轉(zhuǎn)基因蠶制作成功。下一步我們將以H-hBPI23轉(zhuǎn)基因系為基礎(chǔ)，利用Western方法分析轉(zhuǎn)基因蠶繭中重組hBPI23蛋白的含量，并通過(guò)添加革蘭氏陰性菌等方法，檢測(cè)和評(píng)估H-hBPI23蠶絲的抗菌活性。