劉勝勝 喻 艷 成希飛 周 游 徐 立

(西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，重慶 400715)

國內(nèi)外學(xué)者普遍認(rèn)為，很多疾病及人體的衰老等都和體內(nèi)的氧化和自由基的存在有密切關(guān)系，具有抗氧化和清除自由基的活性物質(zhì)市場需求極大。目前人工合成的抗氧化劑如叔丁基對甲酚(BHT)、叔丁基羥基回香醚(BHA)、叔丁基氫醌(TBHQ)、沒食子酸丙酯(PG)存在毒副和致癌等安全問題[1],因此，隨著人們保健意識的加強，亟待從自然界中開發(fā)更多天然無毒的抗氧化劑。黃酮類化合物是天然化合物中具有很好抗氧化和清除自由基活性的典型化合物類型[2]。

桑枝為?？浦参锷orusalbaL.的干燥嫩枝，是常用中藥材之一，衛(wèi)生部也將其提取物歸為可以加入到食品和保健品中的植物材料，具有較好的食用安全性。同時，桑枝中黃酮類成分含量較高，有的品種高達(dá)3. 89～3.97 mg/g[3]，其中具有代表性的黃酮類化合物為蘆丁、桑色素和槲皮素[4]。此前，對于這3種代表性黃酮的含量和抗氧化、清除自由基的活性雖有研究，但比較分散，不夠系統(tǒng)[5]。本實驗采用高效液相色譜法，對桿壯葉肥的超高產(chǎn)人工三倍體桑樹品種—嘉陵20號桑枝中3個主要黃酮類成分蘆丁、槲皮素、桑色素的含量進(jìn)行測定，與其抗氧化、清除自由基活性相結(jié)合，系統(tǒng)地評價桑枝提取物被開發(fā)為天然抗氧化劑的潛力，不僅為開發(fā)天然抗氧化劑奠定理論基礎(chǔ)，也為桑產(chǎn)業(yè)廢棄物的高值化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

嘉陵20號桑樹新鮮桑枝，采自西南大學(xué)“桑之源”桑園。

蘆丁、槲皮素、桑色素、維生素E對照品(純度≥98%，成都曼思特生物科技有限公司)，乙醇、甲醇、雙氧水(H2O2)(AR級，重慶川東化工有限公司)，三氯乙酸、氯化鐵、高硫酸鉀、鐵氰化鉀、磷酸二氫鉀、氫氧化鉀(AR級，成都科龍化工試劑廠)，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2, -聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)(AR級，南京都萊生物技術(shù)有限公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)儀(美國Waters公司)、InertSustainC18柱(4.6×250 mm，5 μm，日本)、R-210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司)；純水儀(法國Millipore公司)、B-491恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)、粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司)、QL-901渦旋儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)、BIORAD酶標(biāo)儀(美國Biorad公司)、紫外分光光度計(德國Thermo公司)、ZF-90型暗箱式紫外透射儀(上海顧村電光儀器廠)。

1.3 樣品制備

采集100g新鮮枝條，粉碎，50℃恒溫干燥，過200目篩，收集過篩后的細(xì)粉末。準(zhǔn)確稱取15g桑枝粉末，加入錐形瓶中。以液料比33∶1向錐形瓶中加入石油醚，并混合均勻，室溫下浸泡1h，過濾，收集濾液，按照上述步驟重復(fù)提取，總共提取3次。待濾渣中石油醚揮發(fā)干后，在80 ℃下，用70%乙醇，以液料比33∶1浸提120min，過濾，再將濾渣放入錐形瓶中，重復(fù)3次。濾液在40℃、0.1MPa條件下減壓濃縮至浸膏(樣品)。將樣品置于4℃條件下，黑暗保存，備用。

1.4 總黃酮含量測定

將浸膏狀態(tài)的樣品用70%乙醇溶解，濃度調(diào)至8mg/mL。準(zhǔn)確吸取1mL樣品，加入5%亞硝酸鈉溶液0.4mL，震蕩搖勻，靜置5min，再加入0.4mL10%的硝酸鋁溶液，震蕩搖勻，靜置5min，加入4mL5%的氫氧化鈉溶液，震蕩搖勻，定容至10mL，靜置10min，在510nm處以70%乙醇為空白對照測定樣品的吸光值。每個試驗重復(fù)三次。由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算黃酮總量。標(biāo)準(zhǔn)曲線：使用70%乙醇配制濃度分別為0、0.1、0.2、0.4、0.5mg/mL的蘆丁溶液，按照上述方法反應(yīng)及測定其吸光值，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，做出蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線(0.01～0.05mg/mL)。所測樣品的總黃酮濃度以其吸光值所對應(yīng)的蘆丁的濃度表示，記為每mL溶液含x mg蘆丁，即x mg RE/mL SV。總黃酮得率(%)=[c×5×100/(m×1000)]×100%，c為黃酮濃度(mg/mL)，m為桑枝質(zhì)量(g)。

1.5 HPLC測定3種代表性黃酮含量

色譜條件：色譜柱為InertSustainC18(4.6×250 mm，5 μm)；流動相為甲醇(A)和0.3%磷酸(B)溶液，梯度洗脫參考喻樊等的研究方法[6][0～6 min A-B(45∶55)；6～13 min，A-B(40∶60)；13～40 min，A-B(55∶45)]；進(jìn)樣量10μL；檢測波長為360nm；流速為1.0mL/min；柱溫為30℃。

1.6 DPPH·清除力測定

參考Mohammad等[7]和Garry等[8]方法，分別取0.1mL不同濃度(0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg/mL)的維生素E、蘆丁、槲皮素、桑色素和桑枝總黃酮提取物溶液，分別與0.1mL 800mmol/L的DPPH·乙醇溶液混合，震蕩搖勻，室溫下避光反應(yīng)30min后，利用酶標(biāo)儀在490nm處測定吸光值。各濃度設(shè)置三個重復(fù)，求平均值?？瞻捉M以等量的無水乙醇代替800mmol/L的DPPH·乙醇溶液，對照組以等量的70%乙醇代替樣品，測定吸光值。清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/Ao]×100%，其中Ai、Ao、Aj分別為樣品組、對照組和空白組的吸光值。根據(jù)公式計算出各樣品清除DPPH·的IC50。

1.7 ABTS+清除力測定

參考Roberta等[9]和Milleran等[10]方法，配制ABTS+工作液，分別取100μL不同濃度(0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg/mL)的維生素E、蘆丁、槲皮素、桑色素和提取物溶液，分別與100 μL ABTS+工作液混合，震蕩30s，靜置反應(yīng)10min，利用酶標(biāo)儀在750nm的波長下測定吸光值。每個濃度設(shè)置三個重復(fù)，求平均值。空白組以等量無水乙醇代替ABTS+工作液，對照組以等量的70%乙醇代替樣品溶液，測定吸光值， 清除率 (%)=[1-(Ao-B)/At]×100%，其中Ao，At，B分別為對照組、樣品組、空白組的吸光值。根據(jù)公式計算出各樣品清除ABTS+的IC50。

1.8 總還原力測定

參考Michal等方法[11]，分別取不同濃度(0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg/mL)的各樣品0.45mL，加入5mL的離心管，向各離心管中分別加入(0.2mol/L，pH 6.6)PBS緩沖液0.45mL，混合均勻，再加入0.45mL[K3Fe(CN)6](質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%)，混合均勻，于50℃下水浴20 min后，冰浴，以快速冷卻，再向混合液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸溶液0.45 mL，混合搖勻，以終止反應(yīng)。最后再加1.8mL蒸餾水和0.1mL，0.1%三氯化鐵反應(yīng)10min后于700nm 測其吸光度，吸光值大小與還原力強弱呈正相關(guān)?？瞻捉M以等量的70%乙醇代替樣品，每個樣品設(shè)置三個重復(fù)。

1.9 DNA損傷保護(hù)潛力測定

在微型離心管中依次加入5 μL(60 ng/μL)pUC19質(zhì)粒DNA ，2 μL H2O2和5 μL(2mg/mL)的樣品溶液。對照組以等量無菌水代替樣品溶液，空白組加入5μL(60ng/μL)pUC19質(zhì)粒DNA和7μL ddH2O。參考文獻(xiàn)方法[12]，樣品組和對照組于310nm紫外光線下進(jìn)行5min表面輻射，空白組不進(jìn)行紫外處理。隨后載入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 種常見黃酮類化合物的含量

表1 3種代表性黃酮的線性方程及含量(n=3)

根據(jù)總黃酮得率公式和標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Y = 12.041X-0.01(r=0.9997)計算出桑枝提取物中總黃酮得率為1.01±0.04%，比吳志平等[3]測定的22個桑品種的春季嫩桑枝黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)0. 2%～0. 6%要高，由于品種、季節(jié)、成熟度對黃酮的含量均有影響，本實驗材料同樣采于春季(6月)，因此推測可能是品種不同造成的差異，說明嘉陵20號桑樹品種枝條中黃酮成分含量相對較高。

其中3種代表性黃酮類成分蘆丁、桑色素、槲皮素的含量如表1所示，其保留時間分別為10.382、25.303、30.041 min(圖1)。HPLC法的流動相中選擇加入不揮發(fā)的磷酸來改善峰形，結(jié)果顯示采用甲醇-0. 3%磷酸作為流動相進(jìn)行梯度洗脫，3種代表性黃酮成分的分離效果較好。由結(jié)果可知，提取物中蘆丁含量最高，為1.41 mg/g，槲皮素次之，為1.08mg/g，桑色素最低，為0.63mg/g。此外，RSD%分別為1.69、2.35、1.05，都在2%左右，說明儀器精密度良好，實驗結(jié)果可信。

圖1 對照品(a)及提取物(b)的HPLC色譜圖

2.2 自由基清除能力

2.2.1 DPPH·清除效果

不同濃度樣品的DPPH·清除力如圖2所示，桑枝提取物、蘆丁、槲皮素、桑色素對DPPH·均有較強的清除能力，具有明顯劑量效應(yīng)關(guān)系。在試驗濃度范圍(0.02～0.10 mg/mL)內(nèi)，隨著濃度的增加，自由基清除能力逐漸加強。濃度相同情況下，桑色素和槲皮素對DPPH·清除能力都比提取物要強，但遠(yuǎn)弱于陽性對照維生素E。在濃度為(0.02～0.05 mg/mL)時，槲皮素的清除率為最高，但隨濃度增加略低于維生素E，當(dāng)濃度大于0.06 mg/mL后二者清除率相當(dāng)，均遠(yuǎn)高于桑色素、蘆丁和提取物。

根據(jù)SPSS計算得出各樣品的DPPH·清除力的半抑制濃度(圖3)，濃度越小，清除自由基的效果越好。比較各樣品對DPPH·清除能力的IC50，陽性對照維生素E(IC50=0.042mg/mL)最低，槲皮素(IC50=0.042mg/mL)與其相當(dāng)，明顯低于其他3種，說明其清除效果最好；其次是桑色素(IC50=0.065mg/mL)，提取物(IC50=0.072mg/mL)，蘆丁最高(IC50=0.082mg/mL)。因此，各樣品對DPPH·清除能力從大到小為：維生素E=槲皮素>桑色素>桑枝提取物>蘆丁。

2.2.2 ABTS+清除效果

各樣品對ABTS+同樣表現(xiàn)出較好的清除效果，根據(jù)圖4，各樣品溶液對ABTS+的清除能力也具有明顯量效關(guān)系。在濃度為(0.02～0.08mg/mL)時，提取物的清除率遠(yuǎn)高于槲皮素、蘆丁、桑色素，且高于陽性對照維生素E，當(dāng)濃度高于0.08mg/mL后，清除率略低于維生素E，與槲皮素相當(dāng)，但仍高于桑色素和蘆丁，蘆丁的清除率一直為最低。根據(jù)SPSS計算的各樣品的ABTS+清除力的半抑制濃度，其中提取物的IC50最低，為0.019mg/mL，說明其對ABTS+清除效果最強。根據(jù)各樣品的半抑制濃度值(圖5)，得出對ABTS+清除能力從大到小依次為：提取物(IC50=0.019mg/mL)>維生素E(IC50=0.031mg/mL)>槲皮素(IC50=0.037mg/mL)>桑色素(IC50=0.050mg/mL)>蘆丁(IC50=0.074mg/mL)。結(jié)合桑枝提取物總黃酮含量及3種黃酮物質(zhì)的含量(表3)分析表明，提取物中對ABTS+具有清除力的貢獻(xiàn)者除了蘆丁、桑色素和槲皮素外，還存在的其他黃酮類成分也具有相同的作用，并且活性很好，值得進(jìn)一步深入研究。

圖2 不同濃度樣品的DPPH·清除率

注：*表示差異顯著(P﹤0.05)圖3 各樣品的DPPH·清除力的半抑制濃度/IC50

圖4 不同濃度樣品的ABTS+清除率

注：*表示差異顯著(P﹤0.05)圖5 各樣品的ABTS+清除力的半抑制濃度/IC50

2.3 總還原能力

由圖6可知，各個樣品均表現(xiàn)出一定的還原能力，物質(zhì)的還原能力也是衡量抗氧化能力的一個指標(biāo)。在一定濃度范圍(0.02～0.10mg/mL)內(nèi)，隨著樣品濃度增加，吸光度增加，表明其還原能力增強，抗氧化能力提高。

注：吸光值大小間接反映樣品總還原能力大小。圖6 各樣品的總還原能力

當(dāng)濃度在0.02～0.08mg/mL內(nèi)時，槲皮素的總還原力最為突出，明顯高于其他三種樣品和維生素E；結(jié)合其在桑枝提取物中的含量(表1)差異，說明提取物的總還原能力并非與黃酮類成分含量成正相關(guān)，且提取物濃度與3種黃酮物質(zhì)濃度相同時，提取物中的3種黃酮類成分的含量極低，故相同濃度下提取物還原能力較槲皮素和桑色素低。

2.4 DNA保護(hù)潛力

正常情況下， DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)盤旋纏繞形成超螺旋DNA。紫外線照射和H2O2會對DNA產(chǎn)生協(xié)同損傷，引起磷酸二酯鍵或共價鍵斷裂，表現(xiàn)為超螺旋結(jié)構(gòu)的DNA變?yōu)榫€狀DNA和松弛狀DNA。不同形態(tài)的DNA在進(jìn)行電泳分析時的電泳淌度不同，超螺旋DNA的電泳淌度最大，其條帶移動速度最快，松弛狀DNA的電泳淌度最小。各樣品對DNA的損傷保護(hù)作用的電泳條帶如圖7所示，通過Image lab 3.0軟件進(jìn)行條帶分析，超螺旋DNA所占百分比越大，且與空白對照越接近，說明保護(hù)效果越好。

0～2：空白組(不經(jīng)處理的DNA)；3～5：對照組(紫外5 min+30% H2O2處理)；6～8：陽性對照組(維生素E)(紫外5 min+維生素E(1 mg/mL)+30% H2O2處理)；9～11：蘆丁組(紫外5 min+蘆丁(1 mg/mL)+30% H2O2處理)；12～14：桑色素組(紫外5 min+桑色素(1 mg/mL)+30% H2O2處理)；15～17：槲皮素組(紫外5 min+槲皮素(1 mg/mL)+30% H2O2處理)；18～20：提取物組(紫外5 min+提取物(10 mg/mL)+30% H2O2處理)；I：環(huán)狀松弛結(jié)構(gòu)(OcDNA)；II：超螺旋結(jié)構(gòu)(ScDNA)。

圖7 各樣品對DNA的損傷保護(hù)

結(jié)果顯示，對DNA的保護(hù)潛力為：槲皮素>桑枝提取物>桑色素>維生素E>蘆丁，其強弱關(guān)系與總還原能力相一致。濃度相同時，槲皮素最強，并且強于桑枝提取物。提取物濃度為10mg/mL，即蘆丁、桑色素、槲皮素的含量分別為0.014 1、0.006 3、0.010 8mg/mL時，此時雖然濃度很小，但其保護(hù)作用明顯比1 mg/mL的桑色素、維生素E和蘆丁強，說明桑枝提取物中還存在大量其他具有保護(hù)DNA作用的黃酮類物質(zhì)，有待進(jìn)一步研究。

3 討論

本實驗采用總黃酮提取工藝對嘉陵20號桑樹枝條進(jìn)行提取，以甲醇-0. 3%磷酸系統(tǒng)作為流動相進(jìn)行梯度洗脫，檢測總黃酮粗提物中3種代表性黃酮類成分蘆丁、桑色素和槲皮素的含量分別為1.41mg/g、0.63mg/g、1.08mg/g，桑枝總黃酮含量得率為1.01%。

從三個方面對嘉陵20號桑枝中3種代表性黃酮進(jìn)行抗氧化活性評價，即自由基清除能力測試、總還原力測試和對DNA的保護(hù)作用。在相同濃度下各樣品(維生素E、蘆丁、桑色素、槲皮素和桑枝提取物)的自由基清除能力差別較大，槲皮素的DPPH·清除力(IC50為0.042mg/mL)明顯比桑枝提取物、蘆丁和桑色素高，且與維生素E相當(dāng)；桑枝總黃酮提取物的ABTS+清除力(IC50為0.019mg/mL)比蘆丁、桑色素、槲皮素強，且高于陽性對照；蘆丁的還原能力相對于其他兩種黃酮成分是最弱的。黃酮類化合物通常由A 環(huán)、B環(huán)和C環(huán)形成大的P-π共軛體系，具有強烈的排斥電子作用，且黃酮類化合物清除自由基的主要活性部位為B環(huán)，B環(huán)上含有酚羥基，處于這個大的共軛體系之中，因此易脫氫提供電子與自由基相結(jié)合，從而將自由基清除。蘆丁、槲皮素、桑色素均為典型的多酚羥基化合物，槲皮素與桑色素的結(jié)構(gòu)差別體現(xiàn)在B環(huán)酚羥基的位置上，前者為B環(huán)鄰二羥基，而后者為B環(huán)間二羥基，環(huán)上羥基位置會影響清除自由基活性，鄰位羥基清除自由基的活性強于間位羥基[13],這能很好解釋為什么槲皮素較桑色素清除能力較強。蘆丁總還原力最弱，可能是由于C環(huán)3位上的糖基化產(chǎn)生空間位阻，影響酚羥基上氫的活性[14]。桑枝總黃酮提取物對DNA的保護(hù)潛力與桑色素和槲皮素相當(dāng)，且均高于陽性對照。各樣品抗氧化性差異與化合物的結(jié)構(gòu)有關(guān)，對不同黃酮類成分結(jié)構(gòu)的研究為其抗氧化性提供了較好的參考，同時避免黃酮類物質(zhì)之間存在的拮抗作用和協(xié)同作用[15]。本實驗得出兩種黃酮并不是主要活性貢獻(xiàn)者，是否存在其他黃酮類物質(zhì)參與協(xié)同作用有待進(jìn)一步深究。

以上結(jié)論說明嘉陵20號桑樹枝條提取物及其中的3種代表性黃酮類成分抗氧化活性明顯，利用前景廣闊，為天然抗氧化劑的開發(fā)提供了實驗基礎(chǔ)。但是對這些成分的作用原理以及相互之間的作用機制還有待深入研究。