楊慶賀,鄭成淑

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低溫弱光脅迫下外源ASA與CaCl2對菊花葉片AsA-GSH循環(huán)的影響

楊慶賀1,鄭成淑2*

1. 山東農(nóng)業(yè)大學后勤管理處, 山東 泰安 271018 2. 山東農(nóng)業(yè)大學 園藝科學與工程學院, 山東 泰安 271018

以切花菊品種‘神馬’為材料，研究了低溫弱光脅迫下乙酰水楊酸（ASA）和CaCl2處理對菊花葉片抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)中防御系統(tǒng)酶活性和抗氧化物質(zhì)含量的影響，探討了ASA和CaCl2緩解菊花對低溫弱光脅迫效應的可能的生理機制。結(jié)果表明：低溫弱光脅迫下，菊花葉片超氧化物歧化酶（SOD）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）、谷胱甘肽還原酶（GR）、單脫氫抗壞血酸還原酶（MDAR）和脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）的活性均呈不同程度先上升后下降趨勢，但與對照相比，外源ASA、CaCl2和ASA+CaCl2處理顯著提高了菊花葉片SOD、APX、GR、MDAR和DHAR活性，其中以ASA+CaCl2處理的效果最為顯著。低溫弱光脅迫下，菊花葉片還原型抗壞血酸（AsA）和還原型谷胱甘肽（GSH）含量減少，氧化型抗壞血酸（DAsA）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量增加，但與對照相比，外源ASA、CaCl2和ASA+CaCl2處理顯著減小了AsA和GSH含量的下降幅度以及DHA和GSSG含量的上升幅度，并減少了菊花葉片H2O2的含量。表明低溫弱光脅迫下，外源ASA和CaCl2處理可通過提高AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)的代謝活動，減輕了活性氧對菊花幼苗的傷害，從而提高了菊花對低溫弱光的耐性，而且ASA與CaCl2復配處理優(yōu)于ASA或CaCl2單獨處理。

菊花; 低溫弱光; ASA; CaCl2; 抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)

北方地區(qū)日光溫室菊花生產(chǎn)中，常因冬季連續(xù)幾天的陰雨雪天，使菊花植株常處于低溫和弱光脅迫環(huán)境中，給菊花的生產(chǎn)造成不良影響[1]。低溫弱光脅迫下，植物體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧物質(zhì)，能夠破壞葉綠體、細胞膜、蛋白質(zhì)及核酸等，擾亂有機體正常生命活動的動態(tài)平衡[2]。

阿司匹林為市售阿司匹林腸溶片（Aspirin entericcoated tablets，Asp），主要成分為乙酰水楊酸[2-（乙酰氧基）苯甲酸]。乙酰水楊酸（ASA）是水楊酸（SA）的衍生物，因其價格低廉，可代替SA在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上應用。SA是植物體內(nèi)普遍存在的酚類化合物，它不僅參與調(diào)節(jié)植物的許多生理過程，如植物開花、種子發(fā)芽、氣孔關(guān)閉、離子吸收等，能誘導提高植物對真菌、細菌和病毒等生物脅迫[3,4]及重金屬、低溫、熱激和鹽害等非生物脅迫的抗性[5-7]。

Ca2+作為外界刺激信號的“第二信使”，廣泛參與并調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的生理生化反應。大量研究表明，Ca2+在多種作物的抗熱、抗冷、抗鹽、抗旱等抗逆性中起著重要作用[8,9]。也有研究表明，外源SA和Ca2+處理可以提高高溫脅迫和低溫脅迫下的植物體內(nèi)保護酶活性，對植物光合系統(tǒng)起到保護作用[9,10]，但ASA和CaCl2處理對菊花低溫弱光脅迫緩解機理的研究未見報道。

本試驗以切花菊‘神馬’（‘Shenma’）為試材，研究ASA和CaCl2單一和復配處理對低溫弱光逆境下菊花葉片AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)中的幾種酶活性及抗氧化物質(zhì)含量的影響，探討ASA和CaCl2對植物抗逆的緩解機理，為ASA和CaCl2的合理利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 植物材料和處理

試驗材料選用切花菊品種‘神馬’（‘Shenma’）。盆栽（基質(zhì)為珍珠巖：蛭石=1:1，v/v）幼苗（1株1盆）在日光溫室內(nèi)自然光照下長至株高約30 cm、葉片數(shù)20片左右時，挑選生長一致、長勢良好的植株共200株，用清水將全株沖洗干凈后，分別用0.05% ASA、10 mmol/L CaCl2、0.05% ASA +10 mmol/L CaCl2處理，以相同條件下噴施蒸餾水的苗為對照（每處理50株），溶液均勻噴灑于菊花葉片正、背面，以不形成可見的液珠為度。間隔24 h連噴2次，第二次噴后24 h后將所有植株移入溫度12 ℃/8 ℃（晝夜），PFD 60 μmol·m-2·s-1的低溫弱光的人工氣候室。光周期均設為白天15 h，黑夜9 h。在低溫弱光脅迫第0、1、3、5、7 d分別選取植株上部第4~5節(jié)位葉片，測定各項指標，3次重復。試驗期間各處理其他環(huán)境條件及管理措施都保持一致。

1.2 測定項目和方法

1.2.1 幾種酶活性和抗氧化物質(zhì)含量測定SOD和APX活性采用[11]的方法。GR、DHAR和MDAR活性參考[12]的方法，AsA和DAsA含量參考[13]方法，GSH和GSSG含量參考[14]的方法，H2O2含量參照[15]的方法測定。采用Excel軟件作圖，采用DPS統(tǒng)計軟件中的Duncan’s新復極差法對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫弱光脅迫下ASA和CaCl2對菊花葉片SOD、APX、GR活性的影響

SOD是植物防御體系中的第一道防線，能催化活性氧（如O2-.、H2O2、·OH、1O2等）歧化生成O2和H2O2，APX則以AsA為電子供體將H2O2還原成H2O，GR可以利用NADPH的電子將GSSG還原為GSH，從而使細胞內(nèi)胱甘肽庫保持在還原狀態(tài)，在維持AsA-GSH循環(huán)的有效運行及對氧化脅迫的響應起重要作用[16]。從圖1可以看出，低溫弱光脅迫下，所有處理的SOD和APX活性均呈先上升后下降趨勢，GR活性只在ASA+CaCl2處理中出現(xiàn)略微上升，其他處理均有所下降。但ASA、CaCl2和ASA+CaCl2處理的SOD、APX和GR活性始終比對照有所增加，在脅迫第7d時，ASA、CaCl2和ASA+CaCl2處理的菊花葉片SOD活性比對照分別增加13.86%、9.03%和18.44%；APX活性比對照分別增加31.11%、16.22%和40.38%，GR活性也比對照分別增加了38.28%、29.27%和51.67%，而且SOD、APX和GR活性在ASA+CaCl2復配處理區(qū)始終保持最高水平，其次是ASA處理優(yōu)于CaCl2處理。說明外源ASA、CaCl2和ASA+CaCl2處理均可提高低溫弱光脅迫下菊花葉片SOD、APX和GR活性，從而增強體內(nèi)清除H2O2的能力。

2.2 低溫弱光脅迫下ASA和CaCl2對菊花葉片單脫氫抗壞血酸還原酶（MDAR）和脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）的活性的影響

MDHAR和DHAR對維持細胞內(nèi)重要的抗氧化劑AsA和GSH水平具有重要作用。GSH是DHAR催化再生AsA的底物，而AsA在APX催化下清除H2O2的過程中，AsA作為電子供體被氧化為MDHA和DHA（氧化型抗壞血酸），然后MDHA和DHA被MDAR和DHAR再還原為AsA，因此MDAR和DHAR是AsA-GSH循環(huán)中再生AsA的兩個重要酶[17]。

圖 1 ASA 和CaCl2處理對低溫弱光脅迫下菊花葉片SOD、APX和GR活性的影響

由圖2可以看出，低溫弱光脅迫下，MDAR和DHAR活性呈先上升后下降的趨勢。ASA、CaCl2和ASA+CaCl2處理的菊花葉片MDAR和DHAR的活性始終比對照保持較高水平。在脅迫第7 d時，與對照相比，MDAR活性分別增加了23.58%、17.35%和34.15%，DHAR活性分別增加了36.88%、22.44%和52.02%。說明ASA、CaCl2和ASA+CaCl2處理提高了菊花葉片AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)的酶活性，從而提高了菊花對低溫弱光脅迫逆境的抵抗力，而且ASA+CaCl2復配處理效果優(yōu)于ASA和CaCl2單獨處理。

圖 2 ASA 和CaCl2處理對低溫弱光脅迫下菊花葉片MDAR和DHAR活性的影響

2.3 低溫弱光脅迫下ASA和CaCl2對菊花葉片抗壞血酸（AsA）和谷胱甘肽（GSH）含量的影響

抗壞血酸（AsA）和谷胱甘肽（GSH）是普遍存在于植物體內(nèi)的小分子水溶性非酶抗氧化物質(zhì)，其代謝途徑AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)在植物清除活性氧，抵抗氧化脅迫，對誘導植物防御基因的表達、穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，促進細胞生長等方面具有重要功能，并且其功能的發(fā)揮與它們的存在形態(tài)密切相關(guān)[18]。由圖3可以看出，低溫弱光脅迫下，菊花葉片還原型抗壞血酸（AsA）和還原型谷胱甘肽（GSH）含量出現(xiàn)下降趨勢，而氧化型抗壞血酸（DAsA）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量出現(xiàn)上升趨勢，而外源ASA、CaCl2和ASA+CaCl2處理與對照相比，明顯減小了菊花葉片AsA和GSH含量下降幅度以及DAsA和GSSG含量上升幅度。說明ASA、CaCl2和ASA+CaCl2處理可以提高菊花葉片AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)中重要的抗氧化酶活性，從而提高了植株的防御性能，其中ASA處理效果優(yōu)于CaCl2處理，而且ASA+CaCl2復配處理效果優(yōu)于ASA和CaCl2單獨處理效果。

圖 3 ASA 和CaCl2處理對低溫弱光脅迫下菊花葉片抗壞血酸和谷胱甘肽含量的影響

Fig.3 Effects of ASA andCaCl2on the contents of ascorbate and glutathione of the leaves of chrysanthemum under the stress of low temperature and poor light

2.4 低溫弱光脅迫下ASA和CaCl2對菊花葉片過氧化氫（H2O2）含量的影響

植物處于逆境脅迫條件時，細胞內(nèi)積累大量的H2O2等活性氧，從而使細胞質(zhì)膜過氧化加劇，對膜系統(tǒng)產(chǎn)生損傷，導致細胞受到傷害。由圖4可知，低溫弱光脅迫下，菊花葉片H2O2含量均呈先迅速上升后下降再回升的趨勢。但ASA、CaCl2和ASA+CaCl2處理顯著減少了菊花葉片H2O2含量上升幅度，說明低溫弱光脅迫下，外源ASA、CaCl2和ASA+CaCl2處理明顯增加了抗氧化酶的活性，從而減少了活性氧對植株的傷害，而且ASA處理的清除H2O2效果比CaCl2處理效果好，而且ASA+CaCl2復配處理的清除H2O2效果比ASA和CaCl2和單一處理效果更好。

圖 4 ASA 和CaCl2處理對低溫弱光脅迫下菊花葉片過氧化氫含量的影響

3 討論

植物在逆境下或衰老時H2O2等活性氧發(fā)生積累并氧化胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子，使細胞膜遭受損害，加速細胞衰老和解體[19]，此時，植物體內(nèi)的SOD、APX、MDAR、DHAR和GR等酶作為AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)中清除H2O2等活性氧的重要抗氧化酶發(fā)揮著重要作用[18]。本試驗結(jié)果表明，低溫弱光脅迫下，外源ASA、CaCl2和ASA+CaCl2處理有效提高了菊花葉片SOD、APX、GR、MDAR和DHAR的活性，同時發(fā)現(xiàn)H2O2出現(xiàn)先上升后下降再回升的趨勢，這可能是因為脅迫初期的H2O2的迅速積累，誘發(fā)了SOD、APX以及MDAR等抗氧化酶的活性，但隨著脅迫時間的延長，菊花體內(nèi)活性氧水平持續(xù)增加，抑制了酶的活性，AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)正常代謝被破壞，導致后期H2O2再一次積累，但是外源ASA、CaCl2和ASA+CaCl2處理均減小了菊花葉片H2O2增加的幅度，說明外源ASA、CaCl2和ASA+CaCl2是通過提高菊花葉片AsA-GSH循環(huán)中的抗氧化酶活性和抗氧化物質(zhì)，有效的減少了H2O2大量積累，從而緩解了低溫弱光對菊花植株的傷害程度。

抗壞血酸（AsA）是細胞內(nèi)糖代謝過程中產(chǎn)生的一種重要的活性氧清除劑，也是AsA-GSH循環(huán)中重要的抗氧化劑。AsA含量、氧化還原狀態(tài)（AsA/DAsA比值）及其合成和代謝相關(guān)酶類活性的變化與植物對環(huán)境脅迫的響應關(guān)系密切，AsA可直接參與超氧陰離子的清除，維生素E的再生和葉黃素循環(huán)中紫黃質(zhì)的還原反應[20]。因此，植物體內(nèi)保持相對穩(wěn)定的AsA水平對細胞正常生理代謝具有重要意義。在本試驗中，低溫弱光脅迫下，外源ASA、CaCl2和ASA+CaCl2處理減小了菊花葉片AsA水平的下降幅度和DHA含量的上升幅度，說明外源ASA、CaCl2和ASA+CaCl2處理可通過提高抗氧化劑AsA水平，減少了H2O2對植物的氧化損傷，提高了菊花抗低溫弱光性。

谷胱甘肽（GSH）與植物對多種環(huán)境脅迫的忍耐能力密切相關(guān)。正常生理環(huán)境下，GSSG在NADPH存在時可被GR還原為GSH，GR活性直接影響細胞GSH庫的水平。當植物處于逆境脅迫時，細胞處于還原力不足狀態(tài)，此時胞內(nèi)GSH含量減少，GSSG含量相對增加，GSH/GSSG比值下降[21]。GSH在植物脅迫抵抗中的主要作用是通過AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)使DAsA再還原成AsA而實現(xiàn)的，因此，在植物細胞內(nèi)保持較高的GSH含量可使膜蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，因此，GSH含量和GR活性水平被認為是機體抗氧化狀態(tài)的重要標志[18]。本試驗結(jié)果表明，低溫弱光脅迫下，所有處理均使菊花葉片GSH和GR水平均下降，而GSSS水平上升，但外源ASA、CaCl2和ASA+CaCl2處理緩解了菊花葉片GSH含量的下降幅度和GSSG含量的上升幅度，說明外源ASA、CaCl2和ASA+CaCl2處理可通過提高GR活性使菊花葉片保持相對較高GSH含量，有效防止菊花在低溫弱光脅迫下細胞膜發(fā)生損傷，提高其忍耐性[22]。

植物在逆境條件下是否受到傷害與植物種類、逆境強度和持續(xù)時間有關(guān)。在逆境初期，植物有一個應激保護反應，SOD、APX、MDAR和DHAR等抗氧化酶的活性增加。植物的自我保護能力有限，隨著脅迫時間的延長，過多的活性氧不能及時有效清除，最終導致植物受到逆境傷害。本研究中還發(fā)現(xiàn)，在幾種抗氧化酶增加的同時，也消耗了大量的AsA和GSH，而它們的產(chǎn)物DAsA和GSSG含量不斷增加。說明菊花在受到低溫弱光脅迫時，抗氧化酶與抗氧化劑是共同協(xié)調(diào)作用，以減輕不良環(huán)境造成的傷害。

總之，外源ASA和CaCl2預處理減輕了低溫弱光脅迫對菊花葉片AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)中抗氧化防御酶和抗氧化物質(zhì)的破壞，使保護酶保持較高活性，使AsA-GSH循環(huán)代謝抑制程度受到緩解，減少了H2O2大量積累，降低了膜脂過氧化的程度，維護膜結(jié)構(gòu)與功能相對完整，提高了菊花抵抗低溫弱光的能力。而且ASA單一處理在增強SOD、APX和GR等活性及減少H2O2產(chǎn)生等方面的效果優(yōu)于CaCl2單獨處理；而ASA和CaCl2二者混合使用，效果優(yōu)于二者單獨使用。但是，ASA和CaCl2對植物的抗逆性機制并非只是在活性氧清除水平上，因此，還需進一步深入研究。

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Effects of Exogenous Acetylsalicylic Acid and Calcium Chloride on AsA-GSH Cycle inChrysanthemum Leaves under Stress of Low Temperature and Poor Light

YANG Qing-he1, ZHENG Cheng-shu2*

1.271018,2.271018,

Taking cut flower chrysanthemum ‘Shenma’ as testmaterial, the effects of acetylsalicylic acid (ASA) and CaCl2treatments on antioxidant enzyme activities and antioxidant substances in the AsA-GSH cycle of the leaves of chrysanthemum under stress of low temperature and poor light were investigated, and the possible physiological mechanisms of ASA and CaCl2was discussed. The results showed that under the stress of low temperature and poor light, the activities of peroxide dismutase (SOD), ascorbate peroxidase (APX), glutathione reductase (GR), monodehydroascorbate reductase (MDAR) and dehydroascorbate reductase (DHAR) of the leaves of chrysanthemum increased at first and then decreased in all treatments, but they increased significantly by the treatments of ASA and CaCl2addition compared with those of controls, and the effects of Induced resistance effect of ASA and CaCl2mixture treatments was better than single ASA or CaCl2.treatment. Also, under the stress of low temperature and poor light, contents of ascorbate (AsA) and glutathione (GSH) decreased while the contents of dehydroascorbate (DAsA) and oxidized glutathione (GSSG) increased in the leaves of chrysanthemum, but ASA, CaCl2and ASA+CaCl2treatments reduced the scope of reduction of the contents of AsA and GSH and the scope of increasing of the contents of DAsA and GSSG of the leaves of chrysanthemum compared with the controls, and also ASA, CaCl2and ASA+CaCl2treatments reduced significantly the contents of H2O2of the leaves of chrysanthemum. The results indicated that ASA and CaCl2treatments could lighten the damage from H2O2by increasing the AsA-GSH cycle systems, so that increase the damage from the stress of low temperature and poor light, Induced resistance effect of ASA and CaCl2mixture was better than single ASA or CaCl2.

chrysanthemum; low temperature and low light; ASA; CaCl2; AsA-GSH cycle

S68

A

1000-2324(2018)03-0495-05

2017-03-14

2017-03-28

楊慶賀(1977-),男,碩士,工程師.研究方向:園林植物與觀賞園藝. E-mail:yqh@sdau.edu.cn

Author for correspondence. E-mail:zcs@sdau.edu.cn