謝春芹,凡軍民,許俊齊,陳庶,曹正

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不同營養(yǎng)條件對(duì)野生蟬花人工固體栽培的影響

謝春芹,凡軍民,許俊齊,陳庶,曹正*

江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程系, 江蘇 句容 212400

為了加快蟬花的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)，在過去的3年里，主要研究了野生蟬花人工固體培養(yǎng)基栽培，將液體菌種接種到不同主料和不同氮源的培養(yǎng)基上，在相同的管理?xiàng)l件下進(jìn)行培養(yǎng)，通過測定蟬花孢梗束的長速、鮮重、生物轉(zhuǎn)化率，比較蟬花在不同培養(yǎng)基上的生長狀況。結(jié)果表明，野生蟬花人工固體栽培的最適培養(yǎng)基為小麥40 g、氮源為蛋清2 g、營養(yǎng)液60 mL。

營養(yǎng)條件; 蟬花; 固體栽培; 生長影響

蟬花((Miq.) Massee)又稱蟬菌、胡蟬、金蟬花、蟬蛹草、蠶茸，分類地位隸屬于子囊菌亞門、球腔菌目、麥角菌科、蟲草屬（Fr. 1818），無性世代為蟬擬青霉（(Miq.) Samson）[1-5]，是一種具有保健功能的大型藥食兩用真菌，亦是我國傳統(tǒng)的名貴中藥，富含核苷、多糖、甘露醇、麥角甾醇等多種活性物質(zhì)[6-10]；具有鎮(zhèn)痛、抗高血壓、雙向免疫調(diào)節(jié)、抑制腫瘤生長及抗炎、改善腎功能等作用[8,11,12]。核苷類物質(zhì)特別是腺苷為蟲草的主要功效成分之一，在我國藥典中就以腺苷含量的高低作為蟲草制品的質(zhì)控指標(biāo)。據(jù)報(bào)道腺苷主要具有舒張血管、降低血壓、減慢心率、抑制血小板聚焦、松弛血管平滑肌、改善心腦血液循環(huán)、防止心律失常、抑制神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和調(diào)節(jié)腺苷酸活化酶活性等的重要藥理作用，且該物質(zhì)廣泛存在于蟲草真菌的代謝與生物合成中[4,5,13-23]。

自然條件下，針闊葉混交林帶中的森林覆蓋率達(dá)65%，海拔在700~950 m，地勢相對(duì)平緩，濕度大的林中最適蟬花生長。在自然條件下，蟬花的出產(chǎn)率非常的低[24]，資源稀少，同時(shí)又以蟬花為原料的藥用保健品在不斷的開發(fā)，再加上長期采挖，自然產(chǎn)量逐年減少，資源日趨枯竭，野生蟬花的數(shù)量已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足國內(nèi)外市場的需求[25]。張紅霞[26]等人研究了人工培育蟬花與天然蟬花中化學(xué)成分的比較，結(jié)果表明人工培育蟬花子實(shí)體中粗纖維的含量為17%，比天然蟬花高約7%，粗蛋白、粗脂肪和灰分的含量則顯著低于天然蟬花。多糖和蟲草酸、尿苷的含量顯著高于天然蟬花，鳥苷含量與天然蟬花比較接近；氨基酸種類和天然蟬花一致，氨基酸總量和人體必需氨基酸總量均低于天然蟬花，但必需氨基酸占總氨基酸的比例稍高于天然蟬花。因此推出人工培養(yǎng)的蟬花產(chǎn)品來替代日益枯竭的自然資源。

目前人工栽培蟬花的產(chǎn)業(yè)剛剛起步，尚處于發(fā)展時(shí)期[3]，尤其是對(duì)人工固體栽培蟬花培養(yǎng)基中的最適碳源、氮源的研究相對(duì)較少，而在實(shí)踐生產(chǎn)中，這是提高野生蟬花產(chǎn)量的關(guān)鍵。為此，本研究開展野生蟬花人工固體栽培最適營養(yǎng)條件的試驗(yàn)研究，以期為野生蟬花的產(chǎn)業(yè)化、規(guī)?；?、高效化人工栽培提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種 及來源野生蟬花菌種：由本課題組從句容地區(qū)野生蟬花子實(shí)體分離、純化獲得。

1.1.2 試驗(yàn)材料 雞蛋、雜交米、玉米、小麥、蕎麥均由當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶生產(chǎn)；溶性淀粉由天津市科密歐試劑有限公司生產(chǎn)；葡萄糖由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；硫酸鎂和磷酸二氫鉀由上海統(tǒng)亞化工科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)；蛋白胨由北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)；檸檬酸由西隴化工股份有限公司生產(chǎn)；B族維生素由華中藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蟬花液體菌種的制備（1）液體培養(yǎng)基的配方試驗(yàn)液體培養(yǎng)基配方：可溶性淀粉60 g，脫脂奶粉30 g，磷酸二氫鉀1.5 g，硫酸鎂3 g，VB1230片，蒸餾水3000 mL，pH6.5。

（2）液體培養(yǎng)基的制備按常規(guī)液體培養(yǎng)基配制方法,將已配制好的液體培養(yǎng)基分裝于500 mL三角瓶內(nèi)、滅菌備用。

1.2.2 蟬花接種與培養(yǎng)按無菌操作的要求，每瓶接入直徑0.5 cm的菌餅塊2塊，接種后三角瓶立即放入恒溫19 ℃的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h，然后放入120 r/min 在搖床振蕩培養(yǎng)3~4 d，出現(xiàn)大量菌絲球即可使用。

1.2.3 蟬花人工栽培固體栽培培養(yǎng)基的制備（1）栽培營養(yǎng)液的配方營養(yǎng)液的配方：葡萄糖36 g，蛋白胨25 g，磷酸二氫鉀3 g，硫酸鎂3 g，檸檬酸3 g，VB1 30片，蒸餾水3000 mL，pH自然。

（2）固體栽培培養(yǎng)基的配方固體培養(yǎng)基配方：雜交米40 g、蠶蛹粉2 g、營養(yǎng)液60 mL，用脫脂奶粉、蛋清、雞蛋代替蠶蛹粉，用玉米、小麥、蕎麥來代替雜交米，每個(gè)培養(yǎng)基配方做3個(gè)重復(fù)。

（3）固體栽培培養(yǎng)基的配制① 栽培料的準(zhǔn)備選用新鮮無霉變的雜交米、玉米、小麥和蕎麥及蠶蛹粉、脫脂奶粉、雞蛋等輔料，按照配方進(jìn)行準(zhǔn)備。玉米應(yīng)提前浸泡12 h，若還是堅(jiān)硬，可以加水煮沸保持20 min直至變軟然后將水瀝干備用。

② 稱量分別準(zhǔn)確稱取雜交米、玉米、小麥、蕎麥各40 g；蠶蛹粉、脫脂奶粉、蛋清、蛋清與蛋黃混勻的雞蛋各2 g。

③ 裝瓶裝瓶時(shí)直接將雜交米、玉米、小麥、蕎麥分別裝入瓶內(nèi)，然后加入適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)液，用聚丙烯塑料薄膜封口、扎緊。

④ 滅菌與接種將裝好培養(yǎng)料瓶放入121 ℃的高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)滅菌40 min，待冷卻至室溫即可接種。按無菌操作要求，每瓶的接入蟬花液體菌種3 mL。

1.2.4 發(fā)菌管理將接種好的培養(yǎng)料瓶放入專用培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)。蟬花菌絲萌發(fā)階段保持黑暗，培養(yǎng)箱溫度為19 ℃+1 ℃，待料面布滿菌絲時(shí)再將培養(yǎng)箱內(nèi)的溫度調(diào)到22 ℃，約10~12 d菌絲長滿培養(yǎng)料的2/3。直到菌絲完全滲入瓶底,才可增加光照。

1.2.5 出草管理當(dāng)菌絲表面出現(xiàn)一些小隆起時(shí)，每天給予10~14 h的散射光照射，刺激原基形成。3~5 d原基即可形成。

原基出現(xiàn)后,溫度控制在18 ℃~22 ℃，空氣相對(duì)濕度為85%~90%，保持恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)空氣清新，待蟬花現(xiàn)蕾并長到2 mm時(shí)，經(jīng)過40~50 d左右，可見瓶中滿布緊密的乳白色鹿角狀孢梗束，當(dāng)孢梗束長到6 cm左右，尚未散孢子時(shí)即可采收。

1.2.6 觀察并記錄接種后觀察液體菌種萌發(fā)吃料情況、菌絲長勢、長滿料的時(shí)間,同時(shí)觀察并記錄蟬花孢梗束長速、孢梗束的產(chǎn)量等。

1.2.7 生物轉(zhuǎn)化率的計(jì)算方法生物學(xué)轉(zhuǎn)化率=（子實(shí)體鮮重/培養(yǎng)料干重）×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 4種主料的培養(yǎng)基對(duì)蟬花生長的影響

培養(yǎng)基中不同主料對(duì)蟬花孢梗束的生長和后期產(chǎn)量存在明顯差異；不同主料的營養(yǎng)成分不同，直接影響蟬花孢梗束產(chǎn)量。蟬花在不同主料的培養(yǎng)基中均可生長，但在不同主料中，蟬花的生長存在著明顯差異，由2次采收的孢梗束鮮重可見小麥主料的產(chǎn)量最高，鮮重達(dá)到29.95 g，其次是喬麥，為24.19 g，玉米最低的，總鮮重為2.15 g（見表1）。

主料培養(yǎng)基的生物轉(zhuǎn)化率小麥最高，為73.31%；其次是蕎麥，為57.6%，再最低是玉米，為5.12%（見圖1）。

表1 4種主料的培養(yǎng)基對(duì)蟬花花孢梗生長的影響

注：數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示顯著水平（<0.01），下同。

Note: the same data after the different small letters mean significant level (< 0.01), the same below.

圖 1 不同主料培養(yǎng)基中蟬花孢梗束的生物轉(zhuǎn)化率

注：圖中數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示顯著水平<0.01，下同。

Note: data in figure after the different small letters mean significant level (< 0.01), the same below.

2.2 雜交米為主料的培養(yǎng)基中添加不同氮源對(duì)蟬花生長的影響

蟬花能利用的含氮物質(zhì)以有機(jī)氮為主，如蠶蛹粉、豆餅粉、脫脂奶粉、酵母膏、雞蛋等，培養(yǎng)基中添加不同氮源對(duì)蟬花孢梗束生長有一定的影響，在以雜交米為主料的培養(yǎng)基中添加不同氮源對(duì)蟬花孢梗束生長速度有差異。由2次采收的孢梗束鮮重可見，培養(yǎng)基中添加蠶蛹粉的孢梗束總鮮重最高，為39.47 g；雞蛋最低，為31.56 g，但從子座長速來看，蠶蛹粉>雞蛋>蛋清>脫脂奶粉（表2）。雜交米主料中添加4種不同氮源的培養(yǎng)基，其蟬花孢梗束的生物轉(zhuǎn)化率存在一定的差異性。蠶蛹粉是雜交米培養(yǎng)基中生物轉(zhuǎn)化率最高的，為49.34%；其次是脫脂奶粉的生物轉(zhuǎn)化率為47.09%，再次是蛋清，為41.34%，最低是雞蛋，生物轉(zhuǎn)化率為39.45%（圖2）。

表2 雜交米主料中添加不同氮源對(duì)蟬花生長的影響

圖 2 雜交米培養(yǎng)基中添加不同氮源的蟬花生物轉(zhuǎn)化率

Fig.2Biological transformation efficiencies ofin hybrid rice medium with different nitrogen source

2.3 玉米主料培養(yǎng)基中不同氮源對(duì)蟬花生長的影響

在玉米主料培養(yǎng)基上添加不同的氮源，其蟬花孢梗束生長存在一定的差異。4種氮源的孢梗束產(chǎn)量均集中在第一次。其中，脫脂奶粉孢梗束的鮮重為7.22 g，顯著地高于雞蛋、蠶蛹粉、蛋清，而產(chǎn)量最低的是蠶蛹粉，鮮重是0.84 g。但孢梗束長速最快的是雞蛋（表3）。

玉米主料中添加4種不同氮源，其蟬花孢梗束的生物轉(zhuǎn)化率存在一定的差異性（圖3），

整體長勢欠佳。脫脂奶粉最高，達(dá)到9.03%，其次是雞蛋，為7.64%；蛋清的生物轉(zhuǎn)化率為3.80%；最低的是蠶蛹粉，為1.05%。

表3 玉米主料培養(yǎng)基中不同氮源對(duì)蟬花生長的影響

圖 3 玉米培養(yǎng)基中添加不同氮源的蟬花生物轉(zhuǎn)化率

2.4 小麥主料培養(yǎng)基中不同氮源對(duì)蟬花生長的影響

在小麥主料中添加不同的氮源，其蟬花孢梗束生長存在一定的差異，在培養(yǎng)基中，添加蠶蛹粉、脫脂奶粉、蛋清、雞蛋的4種氮源的蟬花產(chǎn)量均較好。其中，蛋清的第一次孢梗束為39.47 g，其次的是脫脂奶粉。而孢梗束的長速是蛋清>雞蛋>脫脂奶粉>蠶蛹粉（表4）。對(duì)蟬花孢梗束的生物轉(zhuǎn)化率存在一定的差異性（圖4），小麥培養(yǎng)基中添加蛋清的生物轉(zhuǎn)化率最高，為158.14%；最低的是蠶蛹粉，其生物轉(zhuǎn)化率為131.86%。

表4 小麥主料培養(yǎng)基中不同氮源對(duì)蟬花生長的影響

圖 4 小麥培養(yǎng)基中添加不同氮源的蟬花生物轉(zhuǎn)化率

2.5 蕎麥主料培養(yǎng)基中不同氮源對(duì)蟬花生長的影響

蕎麥主料添加不同的氮源培養(yǎng)基，其蟬花孢梗束生長存在一定的差異（表5），培養(yǎng)基中添加蠶蛹粉的總鮮重達(dá)到54.53 g、孢梗束長速是3.95 mm/d；其次是雞蛋，其鮮重為48.92 g、孢梗束長速是3.46 mm/d；最低的是蛋清，為42.14 g，但其孢梗束長速是最快的，為4.23 mm/d。

同時(shí)，蟬花孢梗束的生物轉(zhuǎn)化率存在一定的差異性，蕎麥主料中添加蠶蛹粉的蟬花孢梗束的生物轉(zhuǎn)化率最高，為129.83%；次是雞蛋，為116.48%；再次是脫脂奶粉，為114.07%；最低的是蛋清，為100.33%（圖5）。

表5 蕎麥主料培養(yǎng)基中不同氮源對(duì)蟬花生長的影響

圖 5 蕎麥培養(yǎng)基中添加不同氮源的蟬花生物轉(zhuǎn)化率

Fig.5 Biological transformation efficiencies ofin buckwheatmedium with different nitrogen sources

2.6 在小麥與蕎麥混合培養(yǎng)基中不同氮源對(duì)蟬花生長的影響

在上述試驗(yàn)的基礎(chǔ)上得出小麥、蕎麥均適合蟬花的生長，將兩種主料混合后，添加不同的氮源作為蟬花栽培的培養(yǎng)基，其蟬花孢梗束生長存在一定的差異（表6）。蟬花在不同氮源的混合培養(yǎng)料中生長均較好，其中以雞蛋為氮源的孢梗束長速最快為3.81mm/d，且第一次采收的孢梗束鮮重、兩次采收的孢梗束總鮮重均達(dá)到最大值，為47.63g、68.95g；明顯的高于蛋清、蠶蛹粉、脫脂奶粉氮源培養(yǎng)基的蟬花。

小麥和蕎麥主料中添加4種不同氮源的培養(yǎng)基，其蟬花孢梗束的生物轉(zhuǎn)化率也存在一定的差異性（圖6）。其中，脫脂奶粉的生物轉(zhuǎn)化率最低，為104.74%，蠶蛹粉高于脫脂奶粉，卻明顯低于蛋清與雞蛋的生物轉(zhuǎn)化率，為137.43%；蛋清與雞蛋相差無幾，但雞蛋的生物轉(zhuǎn)化率最高，為164.17%，比蛋清提高4.45%。

表6 混合培養(yǎng)料中不同氮源對(duì)蟬花生長的影響

圖 6 小麥與蕎麥混合培養(yǎng)基中添加不同氮源的蟬花孢梗束的生物轉(zhuǎn)化率

Fig.6 Biological transformation efficiencies ofsporophore in mixed medium of wheat and buckwheat with different nitrogen sources

3 結(jié)論

3.1 蟬花固體栽培最適宜培養(yǎng)基是小麥主料培養(yǎng)基

在蟬花固體栽培過程中加入雜交米、玉米、小麥、蕎麥等四種主料，其中小麥主料培養(yǎng)基兩潮孢梗束的總鮮重達(dá)到最高，為29.95 g；其生物轉(zhuǎn)化率也達(dá)到了最大，為37.44 g。因此，以小麥為主料的培養(yǎng)基，更適合蟬花子實(shí)體的生長。

3.2 小麥栽培蟬花最適宜氮源是蛋清

添加蠶蛹粉、脫脂奶粉、蛋清、雞蛋4種氮源在小麥培養(yǎng)基中，含蛋清的小麥培養(yǎng)基中兩潮孢梗束的總鮮重達(dá)到最高，為66.42 g；生物轉(zhuǎn)化率為83.03%。因此，在小麥培養(yǎng)基中，蛋清是最適宜的氮源。

在不同主料的培養(yǎng)基中，添加不同氮源，蟬花孢梗束的生長差異顯著。如小麥主料培養(yǎng)基中最適宜的氮源是蛋清，玉米主料培養(yǎng)基中最適宜的氮源是脫脂奶粉，蕎麥和雜交米主料培養(yǎng)基中最適宜的氮源是蠶蛹粉，但蕎麥栽培蟬花孢梗束的產(chǎn)量顯著高于雜交米培養(yǎng)基，同時(shí)小麥與蕎麥混合的主料中最適宜的氮源是雞蛋。因此，在實(shí)踐生產(chǎn)中，要獲得產(chǎn)量高、品質(zhì)好、商品性狀好的蟬花孢梗束，需根據(jù)其栽培主料來選擇適宜的氮源。

近年來蟬花的人工培養(yǎng)受到越來越多的關(guān)注，隨著人工栽培蟬花技術(shù)的不斷進(jìn)步，以大米、小麥等材料作為培養(yǎng)基質(zhì)培養(yǎng)蟬花子實(shí)體獲得了初步成功[26]。同時(shí)經(jīng)過多年的栽培實(shí)踐，已經(jīng)積累了豐富的市場經(jīng)驗(yàn)，形成一套并非寄生于蟲體的蟬花栽培技術(shù)體系，特點(diǎn)是栽培原料廣泛、操作簡單、生產(chǎn)周期短、管理方便、成本低、產(chǎn)量高，很適合大規(guī)模、工業(yè)化生產(chǎn)，為解決野生蟬花資源短缺問題提供了新途徑，也適合在農(nóng)戶中推廣應(yīng)用。未來生產(chǎn)培養(yǎng)基中以含有蠶蛹粉、雞蛋等動(dòng)物源成分效果較佳，可能提供了真菌寄生體內(nèi)類似的激素等促進(jìn)因子[27]，但人工栽培的蟬花盡管只有子座（孢梗束）而無蟲體，外觀上與蟲菌復(fù)蟲的野生蟬花有較大區(qū)別，但其子實(shí)體的藥理成分和含量與野生蟬花相近[5]。同樣可作為有關(guān)藥品或保健品的加工原料。國內(nèi)外市場對(duì)蟬花及其深加工產(chǎn)品的需求量很大，蟬花人工栽培具有廣闊的前景。

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Effects of Different Nutritional Conditions on Artificial Solid Cultivation of Wild

XIE Chun-qin, FAN Jun-min, XU Jun-qi, CHEN Shu, CAO Zheng*

212400,

In order to accelerate the industrialization development ofthe cultivation of wildin artificial solid medium was studied in the past three years. The liquid strains were inoculated on different culture medium with different main materials and different nitrogen sources, under the same management conditions, the growth status of cicada flower on different media was compared by measuring the growth speeds, fresh weight and biological transformation efficiencies of the flower sporophore growth. The results showed the optimum medium for artificial solid cultivation of wild cicada flower was wheat 40 g, nitrogen source 2 g, nutrient solution 60 mL.

Nutritional conditions;, solid cultivation, influence on growth

S646.9

A

1000-2324(2018)03-0477-07

2016-10-03

2017-01-20

2015年江蘇省“六大人才高峰”資助項(xiàng)目(2015-NY-024);江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院項(xiàng)目(2017KJ238 );鎮(zhèn)江市“1+1+N”新型農(nóng)業(yè)技術(shù)項(xiàng)目(ZJNJ[2017]06)

謝春芹(1976-),女,碩士,副教授,主要從事食藥用真菌教學(xué)與研究. E-mail:xiechunqin@163.com

Author for correspondence. E-mail:963243057@qq.com