薛瑋瑩,申雁冰,黃煒,王敏,鄧銘倩

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復合誘變選育氫化可的松高轉化率菌株

薛瑋瑩,申雁冰*,黃煒,王敏*,鄧銘倩

工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室, 天津市工業(yè)微生物重點實驗室, 天津科技大學生物工程學院, 天津 300457

藍色犁頭霉（）是轉化17-羥基孕甾-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯（RSA）生成氫化可的松（簡稱HC）的生產菌株。因保藏菌種退化，為了進一步提高HC生產水平，對保藏菌株分離純化后，利用常壓室溫等離子體誘變（簡稱ARTP）和ARTP-LiCl復合誘變的方法對一株藍色犁頭霉進行了誘變。建立了以菌落形態(tài)為標準的初篩方法，選取培養(yǎng)6 d后菌落顏色較深、背面呈環(huán)狀紋路、菌絲較密集的菌株進行HC轉化復篩，得到一株遺傳穩(wěn)定性較好的菌株AL-172，RSA濃度為3.5 g/L時，HC轉化率達72.52%，底物投料濃度和HC轉化率較實驗室保藏菌株分別提高了40%和16.20%，具有良好的應用前景。

氫化可的松; 藍色犁頭霉; 誘變育種; 菌落形態(tài); ARTP

氫化可的松（Hydrocortisone，簡寫HC）又稱皮質醇、可的索，化學名為11,17,21-三羥基孕甾-4-烯-3,20-二酮，屬腎上腺皮質激素類藥物，是激素類藥物中產量最大的品種之一，也是許多甾體激素類藥物的中間體[1]。利用微生物的11-羥基化作用能生成HC的底物很多，其中應用最普遍的是RS（化學名17,21-二羥基-孕甾-4-烯-3,20-二酮）和RSA[2]。在自然界中發(fā)現(xiàn)許多微生物具有甾體11-羥基化能力，其中霉菌最多。目前已應用于工業(yè)化生產的菌種有兩種，一是國外普遍采用的新月彎孢霉（），二是我國采用的藍色犁頭霉（）[3-5]。

藍色犁頭霉轉化RSA生產HC過程中，存在菌種退化，副產物表氫化可的松（11-Epihydrocortisone，EHC）比例高，菌株轉化率較低等問題[9,10]。本研究首先將已退化的保藏菌株進行分離純化，并根據(jù)菌落形態(tài)和轉化率關系建立初篩方法，挑選出轉化率高的菌株進行常壓室溫等離子體誘變（ARTP）和ARTP-LiCl復合誘變，通過菌落形態(tài)進行初篩，搖瓶復篩，篩選出一株轉化能力強，副產物較少的HC生產菌株，對提高HC產量，增強我國HC市場競爭力，促進相關企業(yè)發(fā)展有著重要意義。

1 材料和方法

1.1 菌種和培養(yǎng)基

菌種：藍色犁頭霉（），由天津科技大學微生物制藥研究室保存。

種子和發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：玉米漿12，酵母膏2.5，硫酸銨5，葡萄糖10.5，pH6.4~6.7。

PDA培養(yǎng)基（g/L）：土豆200，葡萄糖20，瓊脂20。

1.2 儀器

ARTP室溫等離子誘變系統(tǒng)，北京思清源生物科技有限公司；CH20BIMF 200雙目顯微鏡，日本OLYMPUS；Agilent 1260 型HPLC儀，美國Agilent。

1.3 初篩方法建立

根據(jù)菌落形態(tài)特征和HC轉化率之間的關系建立初篩方法。將藍色犁頭霉孢子懸液梯度稀釋后涂布，挑取單菌至空白平板，培養(yǎng)并觀察菌落形態(tài)。根據(jù)不同菌落形態(tài)特征對菌株進行分類，測定具有同一菌落特征菌株的轉化率，確定高產菌株具有的菌落特征，作為初篩條件。

1.4 甾體轉化實驗

菌種活化及斜面培養(yǎng)：將藍色犁頭霉菌株接種于斜面培養(yǎng)基上，28 ℃下培養(yǎng)7 d，至孢子成熟。

甾體轉化：無菌水洗下斜面種子，制成3×107個/mL的孢子懸浮液。取1 mL孢子懸浮液接種于種子培養(yǎng)基中，于28 ℃、150 r/min培養(yǎng)17 h。按10%的接種量將種子接種于250 mL三角瓶中的30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，在同樣條件下培養(yǎng)至pH降低至3.8左右時，調節(jié)pH至5.4，投入1.2 mL底物RSA乙醇溶液（RSA終濃度為2.5 g/L），繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取樣測定HC轉化率。

1.5 ARTP誘變方法

本實驗利用ARTP對藍色犁頭霉的孢子進行誘變，電源功率110 W，工作氣體為99.99%氦氣，樣品與等離子體發(fā)射源距離為3 mm，工作氣體流量為10 L/min，操作溫度控制在26.0~30.0 ℃。

將斜面上的孢子洗下制成孢子懸液，調整孢子懸液濃度至1×106個/mL。取10 μL孢子懸液滴加在無菌載片上。選取適宜誘變時間進行誘變，將誘變后的孢子洗下涂布在平板上，挑取單菌培養(yǎng)，選取符合初篩條件的菌株進行復篩。

1.6 ARTP-LiCl復合誘變

ARTP誘變同方法1.5，誘變后洗下孢子懸液涂布于含有不同濃度LiCl的PDA平板上，挑取單菌培養(yǎng)，選取復合初篩的菌株進行復篩。

1.7 分析檢測方法

式中：其中為不經過誘變處理對照菌的總菌落數(shù)，為經誘變處理后對應的總菌落數(shù)。

1.7.2 LiCl致死率測定選取LiCl的濃度梯度為0，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%，3.5%，4.0%，4.5%，5.0%，5.5%，6.0%（w/v）。將孢子懸液梯度稀釋后涂布，進行單菌落計數(shù)，對比未經LiCl處理的單菌落數(shù)，根據(jù)公式計算致死率。

1.7.3 甾體化合物分析檢測方法采用HPLC法，轉化液樣品用兩倍量乙酸丁酯萃取，取100 μL有機相于1.5 mL離心管中，揮干后加1 mL流動相溶解，12000r/min離心10 min。然后用高效液相色譜儀檢測，色譜柱為Eclipse C18（3.5 μm，150 mm×4.6 mm）；流動相為V甲醇:V水=30:70；流速0.8 mL/min；柱溫25 ℃；進樣量20 μL；檢測波長：240 nm。

2 結果與分析

2.1 初篩方法建立

文獻研究表明，在霉菌誘變育種的過程中，可以根據(jù)霉菌的菌落形態(tài)特征建立初篩方法[11-13]。本研究對實驗室保藏菌株進行分離純化，將單菌轉接在PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)6 d后，分析菌落顏色、菌落背面形態(tài)、菌絲疏密與HC轉化率之間關系，據(jù)此建立初篩方法。

2.1.1 菌落顏色與轉化率的關系經過6 d培養(yǎng)后，菌絲已經基本覆蓋整個平板，形成菌落的菌絲大部分已經完全成熟并形成孢子。如圖1所示，菌絲完全成熟并產生孢子時，菌落的顏色主要由菌絲顏色、孢子自身的顏色和孢子數(shù)量決定。將菌株根據(jù)培養(yǎng)6 d后菌落顏色深淺進行分類，并檢測其轉化率。由表1可知，培養(yǎng)6 d后菌落顏色較深菌株的轉化率明顯偏高。

圖1 培養(yǎng)6 d后菌落顏色

a：菌落顏色較淺 The bacterial colony color was lighter；b：菌落顏色居中 The bacterial colony color was mediate；c：菌落顏色較深 The bacterial colony color was deeper

表1 菌落顏色和轉化率之間關系

注：“++”代表顏色較深，“+”代表顏色居中，“-”代表顏色較淺。

Note: ++ presented the deeper color; + presented the mediate color;- presented the lighter color.

2.1.2 菌絲疏密程度與轉化率的關系菌落形成后，由于菌株生長活力不同，菌絲的疏密程度不同。生長能力較強的菌株，菌絲生長的相對密集；反之，生長能力較差的菌株，形成菌落后菌絲則相對稀疏。如圖2所示，在透射光照射的情況下菌絲疏密的差別尤為明顯。將菌株分類后測定其轉化率如表2所示，從中可看出，培養(yǎng)6 d后菌絲生長較密集的菌株轉化率相對較高。

圖2 培養(yǎng)6 d后菌絲疏密度

a：菌絲較稀疏 The sparser mycelinum；b：菌絲疏密度居中 The mediate mycelium；c：菌絲較密集 The denser mycelium

表2 菌絲疏密度和轉化率之間關系

注：“++”表示菌絲密集，“+”表示菌絲疏密度居中，“-”表示菌絲稀疏。

Note: ++ presented the dense mycelium; + presented the mediate mycelium; - presented the sparse mycelium

菌落顏色和菌絲疏密度共同表征了菌株的生長狀況和成熟速度。培養(yǎng)6 d后，菌絲密集的菌株菌絲生長較快，菌落顏色較深的菌株菌絲成熟較快，二者共同決定了菌株的生長和成熟情況。

2.1.3 菌落背面形態(tài)與轉化率的關系菌絲完全覆蓋平板后，菌落背面形態(tài)也有一定差別，如圖3所示，一種形態(tài)為菌落在生長過程中背面形成環(huán)形紋路，由接種的位置向平板邊緣形成斷續(xù)的一環(huán)一環(huán)猶如靶環(huán)狀紋路；另一種形態(tài)為菌落在生長過程中形成的背紋成星狀向外擴散。背紋體現(xiàn)了菌落在生長過程中的生長“軌跡”，一定程度上代表了菌株的生長特性。根據(jù)背紋形態(tài)將菌株分為兩類，轉化率測定結果如表3。菌落背紋呈環(huán)狀的菌株的轉化能力要優(yōu)于背面沒有環(huán)狀背紋的菌株。

圖3 培養(yǎng)6 d后菌落背面形態(tài)

Fig.3 Colonial morphology on the back of plate after 6 days culture

a:菌落背面呈環(huán)狀紋路The cyclic lines on the back of bacterial colony; b:菌落背面形成星狀紋路 The stellated lines on the back of bacterial colony

表3 菌落背面形態(tài)和轉化率之間的關系

在現(xiàn)有的藍色犁頭霉誘變育種研究中，未見報道有快捷有效的初篩方法。本研究根據(jù)霉菌誘變育種過程中菌落形態(tài)的差異，根據(jù)藍色犁頭霉菌落形態(tài)特性與具有同一特性的菌株轉化能力的平均值之間的關系建立初篩方法，將菌落顏色較深、菌落背面呈環(huán)狀、菌絲較密集作為初篩標準，一定程度上提高了誘變育種的效率。

2.2 ARTP誘變菌株的獲得

2.2.1 ARTP誘變時間的確定誘變時間通常通過誘變致死率確定，致死率過高，所得誘變菌株較少；致死率太低，突變率較低。考察了ARTP系統(tǒng)分別作用不同時間時出發(fā)菌株的致死率，致死率曲線如圖4所示。由于不同菌株在不同致死率下可能呈現(xiàn)不同的正變率，在不確定致死率與正變率關系的條件下，為了增加正變菌株篩選的幾率，選擇致死率分別為84.73%，43.71%，26.65%時對應的照射時間50 s、35 s、30 s作為誘變時間。

圖4 ARTP誘變的致死率曲線

2.2.2 ARTP誘變菌株的獲得對ARTP誘變后的菌株進行初篩和復篩，挑選出三株HC轉化率較高的菌株，轉化率分別為69.85%、69.53%和69.45%。對此三株菌株進行遺傳穩(wěn)定性檢測，菌株傳代五次后，均體現(xiàn)良好遺傳穩(wěn)定性。轉化率最高的菌株編號A-42，菌株的轉化率提高至69.85%，較出發(fā)菌株的轉化率增幅6.7%。以A-42作為ARTP-LiCl復合誘變的出發(fā)菌株。

2.2.3 LiCl添加濃度的確定不同LiCl濃度對孢子液的作用強度不同，在作用時間相等的情況下，LiCl濃度越高，作用強度越強。實驗測定了LiCl濃度對菌株致死率的影響，結果表明LiCl添加量為1.5%、2.0%、2.5%時，致死率分別為35.06%，57.78%，84.44%。致死率保持在35%~85%的區(qū)間內，可以保證有一定數(shù)量的菌株存活，又能保證有一定的誘變作用。選取1.5%，2.0%，2.5%的LiCl添加濃度進行復合誘變實驗。

2.2.4 ARTP-LiCl復合誘變菌株的獲得根據(jù)2.2.1所述，仍采用30 s、35 s、55 s三個ARTP照射時間下的孢子混合液進行復合誘變。將孢子混合液梯度稀釋后，涂布于含有LiCl的PDA平板上進行復合誘變，1 d后挑取單菌落至不含LiCl的PDA平板上進行培養(yǎng)。經初篩和搖瓶轉化復篩測定，有18株菌株轉化能力有較大提高。結果如圖5所示，菌株AL-171、AL-172、AL-177對HC的轉化能力最強，轉化率分別為74.82%，74.87%，74.72%，且副產物含量較少。

對此三株菌株進行遺傳穩(wěn)定性分析，選擇遺傳穩(wěn)定性優(yōu)良的菌株進行條件優(yōu)化。由表4可知，AL-172菌株對于HC的轉化率保持在73.98%~74.87%之間，與另兩株誘變菌株相比轉化率較高，且實驗平行性較好，遺傳穩(wěn)定性較強。AL-172菌株比A-42菌株增幅7.53%，比保藏菌株的轉化率（62.41%）增幅19.96%。因此選取菌株AL-172進行后續(xù)試驗。

圖5 ARTP-LiCl復合誘變菌株轉化率

表4 ARTP-LiCl復合誘變菌株遺傳穩(wěn)定性測定

2.3 誘變菌株的高底物濃度生物轉化反應

保藏菌株的HC轉化率較低，不僅因為其副產物較多，對于底物的轉化能力也較弱。搖床轉化36 h后，其底物RSA仍有殘留。誘變后菌株AL-172在24 h時底物已基本轉化完全，對底物轉化能力較強，因此探究其對高濃度底物的轉化作用。在其他條件都不變的基礎上，考察了不同底物濃度對生物轉化反應的影響，結果如圖6所示。

圖6 不同底物濃度下HC的轉化情況

由圖6可知，隨著底物濃度升高，HC的轉化率略有降低，副產物和底物的剩余量略有升高。當?shù)孜餄舛葹?.5 g/L時，HC轉化率達到72.52%，EHC含量略有升高，達到18.18%，且RSA和RS基本轉化完全，較保藏菌株有較大提高。隨著底物濃度升高，底物殘留增加，因此將最適投料濃度確定為3.5 g/L。根據(jù)現(xiàn)有研究報道，藍色犁頭霉菌株在96 h內，投料量2%的條件下，HC的轉化率在50%，另外生成25%的副產物[14]。誘變菌株AL-172轉化率及專一性明顯優(yōu)于已有報道水平。

3 結論

采用ARTP誘變和ARTP-LiCl復合誘變的方法對轉化RSA生成HC的藍色犁頭霉菌株進行了誘變。在此過程中，建立了以菌落形態(tài)為初篩標準的初篩方法，確定了在PDA平板上培養(yǎng)6 d后菌落顏色較深、菌落背紋呈環(huán)狀、菌絲較密集作為初篩條件。誘變得到一株轉化率高達74.87%的菌株AL-172，比實驗室保藏菌株轉化率提高了19.96%。在高濃度底物發(fā)酵實驗中，菌株AL-172在底物濃度為3.5 g/L的高底物濃度轉化過程中，轉化率達到72.52%，較保藏菌株在投料濃度增加40%的條件下，轉化率增幅16.20%。該菌株具有良好的工業(yè)應用前景。

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Breeding Strains with Compound Mutation for High Conversion Rate of Hydrocortisone

XUE Wei-ying, SHEN Yan-bing*, HUANG Wei, WANG Min*, DENG Ming-qian

300457,

is a production strain that converts 17 alpha-hydroxyprogesterone - 4-ene-3, 20-di-21-acetate (RSA) into hydrocortisone (HC). The preserved strain could degenerate, in order to further improve the level of HC production, after the isolation and purification of the preserved strain, the mutagenesis was carried out by using the compound mutagenesis method of Atmospheric temperature Plasma (art) and ARTP-LiCl. The primary screening method was established on the basis of colony morphology. After 6 days of culture, the colony color was darker, there was cricoid markings on the back, HC conversion was rescreened in the bacterial strain with dense mycelium, and the mutant AL-172 with high genetic stability was obtained. When the RSA concentration was 3.5 g / L, the conversion rate of HC reached 72.52 %. Substrate feed concentration and HC conversion rate increased by 40% and 16.20% respectively compared with laboratory preservation strains. It has a good prospect of application.

Hydrocortisone;; mutation breeding; ARTP

Q93-335

A

1000-2324(2018)03-0396-06

2016-07-12

2016-12-20

天津市科技計劃項目(15ZCZDSY00510)

薛瑋瑩(1989-),女,碩士研究生. E-mail:wyxue23@163.com

Author for correspondence. E-mail:shenyb@tust.edu.cn; minw@tust.edu.cn