李秀奇馮銳黃振嶺楊燦燦張修國朱春原

?

辣椒疫霉效應(yīng)分子RxLR22034的表達(dá)純化及晶體生長

李秀奇1,馮銳1,黃振嶺1,楊燦燦1,張修國1,朱春原2*

1. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 山東 泰安 271018 2. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 山東 泰安 271018

辣椒疫霉（）作為一種重要的植物病原卵菌，侵染寄主植物時(shí)能夠分泌RxLR效應(yīng)分子，從而激活或抑制植物的防衛(wèi)反應(yīng)，引起植物病害的產(chǎn)生。為了深入研究辣椒疫霉效應(yīng)分子與植物互作的機(jī)制及致病機(jī)理，本文從辣椒疫霉菌株SD33中克隆得到了RxLR22034效應(yīng)分子，以大腸桿菌（DE3）為宿主，進(jìn)行了原核表達(dá)與純化，確定了該基因高效表達(dá)條件。通過親和層析及分子篩層析純化獲得高純度蛋白，借助坐滴法培養(yǎng)優(yōu)化獲得RxLR22034蛋白晶體，X射線衍射獲得2.7?的蛋白晶體數(shù)據(jù)，為后續(xù)解析RxLR效應(yīng)分子蛋白三維結(jié)構(gòu)，從結(jié)構(gòu)生物學(xué)角度探知辣椒疫霉RxLR效應(yīng)分子生理生化功能奠定了基礎(chǔ)。

辣椒疫霉菌; RxLR效應(yīng)分子; 原核表達(dá); 晶體生長

疫霉菌是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要威脅，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)疫霉菌有160多種，可侵染數(shù)千種植物，每年導(dǎo)致的作物產(chǎn)量損失超過幾百億美元[1]。辣椒疫霉（）辣椒疫霉侵染導(dǎo)致，是一種重要的土傳病害，其寄主范圍較廣，可引致辣椒、番茄、茄子、黃瓜、南瓜等多種重要蔬菜作物的疫病[2,3]。據(jù)統(tǒng)計(jì),每年由辣椒疫霉造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)數(shù)十億美元。

因辣椒疫霉寄主范圍廣泛、可侵染模式植物擬南芥和本氏煙、便于操作等,已經(jīng)成為卵菌研究的重要模式種[4]。RxLR效應(yīng)子是近年被廣泛研究的一類的胞內(nèi)效應(yīng)子[5]。卵菌幾乎所有病原菌在與寄主互作過程中,都向寄主細(xì)胞分泌大量RxLR效應(yīng)子干擾寄主植物細(xì)胞的正常生理代謝和功能，據(jù)統(tǒng)計(jì)辣椒疫霉向寄主分泌的RxLR效應(yīng)子已鑒定到200多個(gè)。對(duì)這些效應(yīng)子的功能和毒性機(jī)制的研究對(duì)防治辣椒疫霉病害意義重大[6]。

RxLR效應(yīng)因子N-端多為保守的RxLR基序，該基序負(fù)責(zé)將效應(yīng)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)于宿主細(xì)胞[7,8]，RxLR基序兩側(cè)的30~60個(gè)氨基酸具明顯的保守性，而C-端區(qū)域氨基酸變異性較大，后來的研究發(fā)現(xiàn)該區(qū)域具一定的W、Y、L保守域[9]。近來，除開展有關(guān)植物病原菌效應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)解析其調(diào)控寄主細(xì)胞生理變化及其致病分子機(jī)制的信息積累外，還解析了7個(gè)卵菌RxLR效應(yīng)分子結(jié)構(gòu)，分別是4、2、11、54、1、13和5[10-15]，有關(guān)植物病原卵菌效應(yīng)蛋白分子結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究信息積累較少。本研究從辣椒疫霉SD33菌株中克隆鑒定了1個(gè)辣椒疫霉效應(yīng)分子RxLR22034，通過生物信息學(xué)比對(duì)分析，正確預(yù)測了RxLR22034結(jié)構(gòu)特征，然后立足蛋白原核表達(dá)純化技術(shù)，獲得了高純度蛋白，借助坐滴法優(yōu)化培養(yǎng)獲得RxLR22034蛋白晶體，經(jīng)X-ray衍射收集了一套2.4?的數(shù)據(jù)，為后續(xù)解析該效應(yīng)分子三維結(jié)構(gòu)及其揭示其致病分子機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和載體

供試?yán)苯芬呙梗ǎ㏒D33菌株由山東省蔬菜病蟲生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定。大腸桿菌菌株（）Rosetta(DE3)購買自北京全式金生物技術(shù)有限公司；表達(dá)載體pET-28a(+)購買自Novagen公司產(chǎn)品。

1.2 RxLR98344效應(yīng)分子基因克隆

1.2.1 引物設(shè)計(jì)基于生物信息學(xué)軟件比對(duì)分析，根據(jù)RxLR22034基因和pET-28a特點(diǎn)，采用NOTI和NDEI酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物RxLR22034-F:5’-ATAAGAATGCGGCCGCATGCGTCTAAGTGTGATCCT-3’；RxLR22034-R:5’-GGAATTCCATATGTTATGGTCGATGCTTTCCG-3’，另在下游引物酶切位點(diǎn)后面去掉目的基因終止密碼子以產(chǎn)生融合his標(biāo)簽融合蛋白，引物由上海鉑尚生物有限公司合成。利用Signal P 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/Signal P/)數(shù)據(jù)庫預(yù)測基因信號(hào)肽及其結(jié)構(gòu)特征。

1.2.2 RxLR22034基因克隆利用CTAB法提取辣椒疫霉SD33菌株總DNA，以SD33菌株總DNA為模板，以RxLR22034-F和RxLR22034-R為引物擴(kuò)增RxLR22034基因開放讀碼框。PCR反應(yīng)體系：50 L，含10x EasyTaq Buffer 5 L，dNTP 4 L，引物(10 mol/L)各1 L，模板DNA 2 L，EasyTaq酶0.5 L，無菌水36.5 L。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min，變性94 ℃ 30 s，退火58 ℃ 50 s，延伸72 ℃ 30 s，共32個(gè)循環(huán)，72 ℃總延伸10 min。

1.3 表達(dá)載體構(gòu)建

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并利用DNA凝膠回收試劑盒對(duì)目的條帶進(jìn)行回收純化，根據(jù)目的基因引物和克隆載體上選擇使用的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，分別為Not1、Nde1，對(duì)目的片段和載體進(jìn)行雙酶切。利用DNA凝膠回收試劑盒對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行回收純化，純化之后用Solution I連接酶進(jìn)行目的片段和載體的連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入帶有Kana抗性的菌株（DH5α），經(jīng)菌液PCR篩選和測序驗(yàn)證正確后，提取重組質(zhì)粒備用。

1.4 RxLR22034重組蛋白的表達(dá)純化

1.4.1 重組蛋白的試表達(dá)將測序正確的pET28a-RxLR22034重組質(zhì)粒用轉(zhuǎn)入(DE3)菌株中，涂布于具有Kana抗性的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)12 h。挑取生長良好的單克隆至1 mL含有0.1 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，37 ℃，振蕩培養(yǎng)4 h，取800 μL菌液加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，振蕩培養(yǎng)3 h。誘導(dǎo)結(jié)束后各取80 μL菌液，與誘導(dǎo)前的對(duì)照菌液共離心，12000 rpm，2 min；棄上清，各加入40 μL的2×Binding Buffer和40 μL的2×Loading Buffer混勻；煮沸15 min，離心12000 rpm，1 min；15% SDS-PAGE凝膠電泳分析。根據(jù)電泳結(jié)果，將有條帶的剩余菌液200 μL接種于5 mL帶有Kana抗性的新鮮LB培養(yǎng)基中，37 ℃，振蕩培養(yǎng)12 h，取840 μL菌液加入160 μL50%滅菌甘油，于-20 ℃冰箱保存。對(duì)已保存的表達(dá)較好的菌株進(jìn)行活化后，按1:100比例接種到含有50 mg/L Kan的1 L LB培養(yǎng)基中，37 ℃180 rpm震蕩培養(yǎng)至OD600為0.6~0.8。待培養(yǎng)基的溫度降至16 ℃，加入1 mL 1 M的IPTG，16 ℃ 120 rpm過夜培養(yǎng)，離心收集菌體于-20 ℃保存待用。

1.4.2 重組蛋白的純化將菌體重懸于50 mL緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl pH8.5，300 mmol/LNaCl）中，加入10%甘油和0.5%吐溫-20，超聲破碎，4 ℃14000 r/min離心30 min后，去沉淀。將上清液掛鎳柱。鎳柱預(yù)先用buffer A(20 mmol/L Tris-HCl pH8.5，300 mmol/LNaCl，30 mmol/L咪唑)平衡，掛3~4遍，用500 mL buffer A洗雜蛋白，再用buffer B (20 mmol/L Tris-HCl pH8.5，300 mmol/L NaCl，300 mmol/L咪唑)洗脫目的蛋白，將洗脫的目的蛋白用濃縮管濃縮至1 mL。分子篩預(yù)先用buffer c（20 mmol/L Tris-HCl pH8.5，300 mmol/L NaCl）平衡，將濃縮的蛋白上樣，收集主要目標(biāo)峰蛋白，SDS-PAGE檢測純度，并將蛋白用液氮保存于-80 ℃下保存，以備培養(yǎng)晶體使用。

1.5 重組蛋白晶體培養(yǎng)及優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)蛋白晶體的培養(yǎng)，采用坐滴氣象擴(kuò)散法，初次篩選采用Hampton Research Crystal ScreenⅠ、Crystal Screen Ⅱ、Salt RxTM1、PEG/lon Screen TM、PEG/lon 2 Screen TM、Index TM和Natrix TM蛋白晶體生長試劑盒進(jìn)行蛋白晶體篩選。采用進(jìn)口48孔晶體培養(yǎng)板，池液150 L，蛋白液和池液以1:1比例混合，置于10 ℃恒溫晶體培養(yǎng)箱，2周后于顯微鏡下觀察晶體生長情況，后根據(jù)粗篩條件進(jìn)行晶體優(yōu)化，挑取生長質(zhì)量較好的蛋白晶體，用液氮凍存，進(jìn)行X射線衍射分析并收集數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒疫霉RxLR22034基因克隆及基因序列結(jié)構(gòu)分析

辣椒疫霉RxLR22034基因序列分析，該基因全長558 bp，編碼185個(gè)氨基酸，預(yù)測分子量為21.04 KD。利用SignalP4.1 Server預(yù)測RxLR22034基因無信號(hào)肽和跨膜區(qū)（見圖1）。以基因組DNA為模板，用引物RxLR22034-F和RxLR22034-R擴(kuò)增該基因編碼區(qū)序列，電泳檢測結(jié)果（圖2），表明擴(kuò)增產(chǎn)物為558 bp，與基因組中RxLR22034基因大小一致。

圖1 效應(yīng)分子RxLR22034信號(hào)肽預(yù)測與跨膜區(qū)預(yù)測

2.2 RxLR22034蛋白表達(dá)

回收PCR產(chǎn)物，用Not I和Xho I雙酶切回收產(chǎn)物和表達(dá)載體pET-28a。以22034-F和RxLR22034-R為引物，PCR擴(kuò)增22034-pET28a重組質(zhì)粒菌落跑膠獲得約558 bp的特異性條帶（圖3），送樣測序。利用DNAman軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析，測序結(jié)果正確，原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒22034-pET28a轉(zhuǎn)入大腸桿菌（DE3）表達(dá)菌株，誘導(dǎo)后，結(jié)果顯示在37 ℃條件下，經(jīng)0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)宿主菌于21KD處有大量蛋白表達(dá)（圖3）。

圖2 RxLR22034基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖3 RxLR22034誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果

M: Marker, 1~7:基因RxLR22034 M: Marker,1:CK,2~10:加入IPTG后的誘導(dǎo)結(jié)果

M:Marker, 1~7: The gene ofxLR22034 M:marker,1:CK,2~10 with IPTG induced expression.

2.3 RxLR22034蛋白純化

收集RxLR22034融合蛋白菌體，經(jīng)細(xì)胞破碎，進(jìn)行鎳柱親和層析，取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測（圖4）。將融合蛋白濃縮至1 mL，過分子篩層析，分部收集的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測，結(jié)果顯示在21 KD處有蛋白（圖5）。

圖4 RxLR22034蛋白分子篩純化后的SDS-PAGE電泳

圖5 RxLR22034蛋白分子篩層析純化

Fig.5 Purification of RxLR22034 by size exclusion chromatography

2.3 RxLR22034蛋白晶體篩選及衍射數(shù)據(jù)收集

收集分子篩層析洗脫獲得的目的蛋白，濃縮并進(jìn)行晶體初篩，采用坐滴法16 ℃生長1周后，可觀察到晶體生長（圖6），晶體生長條件：0.03 M Citric acid，0.07 M BIS-TRIS propane/pH 7.6，20%PEG3350。然后將晶體送上海同步輻射光源進(jìn)行了X衍射及數(shù)據(jù)收集和初步處理（圖7）。目前由于還缺乏該蛋白晶體的相位信息，后續(xù)正在試圖進(jìn)行該蛋白的硒代衍生物制備，以期獲得衍射效果好的硒代蛋白晶體，并有望最終解析其三維結(jié)構(gòu)。

圖6 RxLR22034蛋白晶體

圖7 RxLR22034晶體X射線衍射圖

3 討論

對(duì)于眾多用生物化學(xué)和生物物理學(xué)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)研究來講，成功獲得高純度高濃度可溶性蛋白溶液是至關(guān)重要的一步。本研究選取了辣椒疫霉全基因組中一個(gè)RxLR效應(yīng)蛋白，該基因在辣椒疫霉全基因組中序列號(hào)為22034，由此將其命名為RxLR22034。本研究從參試?yán)苯芬呙咕鶶D33克隆鑒定了RxLR22034基因，然后進(jìn)行蛋白表達(dá)純化，獲得高純度蛋白，后續(xù)進(jìn)行晶體優(yōu)化培養(yǎng)，獲得高質(zhì)量的晶體，綜合分析本研究實(shí)驗(yàn)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，目的蛋白純度大于90%以上，適宜進(jìn)行晶體篩選，并利于成功獲得蛋白晶體。

在蛋白純化和晶體篩選過程中，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)鞍准兌冗_(dá)到90%以上，濃度達(dá)到10 mg/mL，適合進(jìn)行蛋白晶體篩選，并利于獲得蛋白晶體。晶體生長的臨界條件是溶液達(dá)到一個(gè)適宜的過飽和度，才會(huì)生成少數(shù)的晶核，隨著溶液過飽和度逐漸降低，最后溶液和晶體處于平衡狀態(tài)，晶體就停止生長。本研究結(jié)果對(duì)后續(xù)開展硒代蛋白晶體培養(yǎng)，以及X射線衍射分析提供了可靠的實(shí)驗(yàn)技術(shù)準(zhǔn)備。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步的晶體優(yōu)化和硒代培養(yǎng)，有望解析其全長三維結(jié)構(gòu)，預(yù)期利于立足RxLR22034蛋白三維結(jié)構(gòu)，深入探討辣椒疫霉效應(yīng)分子蛋白與辣椒寄主互作的分子機(jī)制，從而為設(shè)計(jì)植物抗疫病策略奠定理論基礎(chǔ)。

近年來卵菌RxLR效應(yīng)蛋白與植物互作機(jī)理研究，已逐漸成為分子植物病理學(xué)研究熱點(diǎn)科學(xué)問題，通過解析RxLR蛋白三維結(jié)構(gòu)，立足蛋白三維結(jié)構(gòu)特性，深入開展其功能機(jī)制研究，預(yù)期有望探明辣椒疫霉與植物互作的分子機(jī)制。因此，針對(duì)性的開展卵菌效應(yīng)蛋白表達(dá)、純化，獲得高純度蛋白及其晶體培養(yǎng)，獲得高較高質(zhì)量的晶體，為真正意義上解析其三級(jí)結(jié)構(gòu)提供重要的技術(shù)準(zhǔn)備，對(duì)于深入開展效應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)生物學(xué)具有重要的意義。

4 結(jié)論

本研究從JGI公布的辣椒疫霉基因組中成功克隆得到效應(yīng)分子RxLR22034基因，隨后對(duì)該基因進(jìn)行了蛋白的原核表達(dá)、純化，得到較高純度的RxLR22034母體和硒代蛋白，并對(duì)其進(jìn)行了晶體培養(yǎng)，將RxLR22034蛋白晶體在上海光源中心進(jìn)行X-ray衍射收集數(shù)據(jù)，并收集到了一套高質(zhì)量的RxLR22034母體蛋白衍射數(shù)據(jù)。為下一步解析RxLR22034三維結(jié)構(gòu)打下基礎(chǔ)，為將來闡明RxLR效應(yīng)因子的致病機(jī)理、多寄主侵染機(jī)理以及與寄主共進(jìn)化特點(diǎn)等提供了理論依據(jù)。

[1] 鄭小波.疫霉菌及其研究技術(shù)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,1997

[2] 張海英,劉永剛,呂和平,等.河西地區(qū)辣椒疫病菌的形態(tài)特征及其致病力的初步研究[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2008,17(1):74-76

[3] 王曉敏,鞏振輝,逯紅棟,等.辣椒疫霉菌孢子誘導(dǎo)技術(shù)研究[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2006,15(2):59-62

[4] Kamoun SA. Catalogue of the effector secretome of plant pathogenic Oomycetes[J]. Annu Rev Phytopathol, 2006,44:41-60

[5] Lamour KH, Stam R, Jupe J,. The Oomycete broad-host-range pathogen[J]. Molecular plant Pathology, 2012,13(4):329-337

[6] Du Y, Mpina MH, Birch PR,RxLR effector AVR1 interacts with exocyst component Sec5 to manipulate plant immunity[J]. Plant Physiology, 2015,169(3):1975-1990

[7] Dou DL, Kale SD, Wang X,. RxLR mediated entry ofeffector Avr1b into soybean cells does not require pathogen-encoded machinery[J]. Plant Cell, 2008,20(7):1930-1947

[8] Whisson SC, Boevink PC, Moleleki L,A translocation signal for delivery of Oomycete effector proteins into host plant cells[J]. Nature, 2007,450(7166):115-118

[9] Win J, Komoun S.Adaptive evolution has targeted the C-terminal domain of the RxLR effectors of plant pathogenic Oomycetes[J]. Plant Signaling & Behavior, 2008,3(4):251-253

[10] Boutemy LS, King SR, Win J,. Structures ofRxLR Effector Proteins: a conserved but adaptable fold underpins functional diversity[J]. J Biol Chem, 2011,286(41):35834-35842

[11] Yaeno T, Li H, Chaparro-Garcia A,. Phosphatidy linositol monophosphate-binding interface in the Oomycete RxLR effector AVR3a is required for its stability in host cells to modulate plant immunity[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2011,108(35):14682-14687

[12] Maqbool A, Hughes RK, Dagdas YF,. Abbas Maqbool Structural Basis of Host Autophagy-related Protein 8 (ATG8) Binding by the Irish Potato Famine Pathogen Effector Protein PexRD54[J]. J Biol Chem, 2016,291(38):20270-20282

[13] Chou S, Krasileva KV, Holton JM,. Hyaloperonospora arabidopsidis ATR1 effector is a repeat protein with distributed recognition surfaces[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2011,108(32):13323-13328

[14] Leonelli L, Pelton J, Schoeffler A,. Structural elucidation and functional characterization of the Hyaloperonospora arabidopsidis effector protein ATR13[J]. PLoS Pathog, 2011,7:e1002428

[15] Sun FR, Kale SD, Azurmendi HF,. Structural basis for interactions of theRxLR effector Avh5 with phosphatidylinositol 3-phosphate and for host cell entry[J]. Mol. Plant-Microbe Interact, 2013,26(3):330-344

The Expression, Purification and Crystal Growth of RxLR86034 from

LI Xiu-qi1, FENG Rui1, HUANG Zhen-Ling1, YANG Can-can1, ZHANG Xiu-guo1, ZHU Chun-yuan2*

1.271018,2.271018,

, an important phytopathogenic Oomycete, can infect host plants to secrete RxLR effector molecules, thus activating or inhibiting plant defense responses and causing plant diseases. In order to further study the mechanism and pathogenic mechanism of interaction betweeneffector and plant, In this paper, RxLR22034 effector molecule was cloned fromstrain SD33 and expressed in Escherichia coli(DE3). The expression of this gene was confirmed. The target protein was purified through using a two-steps purification strategy including nicked affinity and size exclusion chromatography (SEC). The high purify protein and well-diffracted crystals were obtained, which laid a foundation for the analysis of the structure. The crystals were obtained by sitting drop method and we obtained 2.4? diffraction data using X-ray. Finally, we prepared the high quality protein of RxLR22034 gene which would be beneficial to further study on crystal structure of it.

; RxLR effector; prokaryotic expression; crystal growth

S436.418.1+2

A

1000-2324(2018)03-0383-05

2017-12-01

2018-02-12

國家自然科學(xué)基金青年基金(31500121);山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家科研獎(jiǎng)勵(lì)基金(BS2015SW009)

李秀奇(1992-),女,在讀碩士研究生,研究方向:植物病原卵菌蛋白結(jié)構(gòu)生物學(xué). E-mail:2292196007@qq.com

Author for correspondence. E-mail:zhuchunyuan@sdau.edu.cn