羅光成，易婷婷，劉素蘭，蔣興亮，郭曉蘭，張國元

(1川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院，四川南充637000；2川北醫(yī)學院；3川北醫(yī)學院轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究中心)

我國乙肝病毒(HBV)感染者約9 300萬，其中慢性乙型肝炎(CHB)患者約2 000萬[1]。我國肝硬化和肝細胞肝癌(HCC)患者中，由HBV感染引起的比例分別為60%和80%[2]。CHB的發(fā)病機制主要是機體的HBV特異性免疫功能紊亂導致病毒不能有效清除，其中HBV特異性T細胞是病毒清除和疾病轉(zhuǎn)歸的關(guān)鍵因素。共刺激分子是T細胞活化的必要分子，可為T細胞活化提供協(xié)同刺激信號，白細胞分化抗原28(CD28)、細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4(CTLA4)和淋巴細胞活化基因3蛋白(LAG3)是調(diào)節(jié)T細胞免疫功能的重要共刺激分子。研究[3,4]表明，共刺激分子在HBV特異性T細胞的產(chǎn)生、數(shù)量維持和功能發(fā)揮方面起著重要作用，在CHB患者T細胞上共刺激分子表達異常，且與疾病進程相關(guān)。既往研究[5,6]發(fā)現(xiàn)，恩替卡韋對CHB患者HBV特異性細胞免疫功能有明顯的影響。然而，關(guān)于恩替卡韋治療對CHB患者血清共刺激分子水平的影響，以及在治療過程中的動態(tài)變化和臨床意義，目前國內(nèi)外鮮有報道。因此，本研究將探討血清共刺激分子CD28、CTLA4和LAG3在CHB患者恩替卡韋治療前后的水平變化及其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2015年10月～2017年4月在川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院感染科就診的CHB患者31例(CHB組)，其中男18例、女13例，年齡(33.5±12.8)歲；符合2010年版《慢性乙型肝炎防治指南》中CHB的診斷標準，HBeAg均陽性；入組前未接受抗病毒治療，入組后參照2010年版《慢性乙型肝炎防治指南》給予核苷類似物抗病毒治療，隨訪均截至2017年4月。對照組23例為川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院體檢中心體檢健康者，均為HBsAg陰性，年齡和性別與CHB組匹配。兩組均排除其他嗜肝病毒重疊感染和人類免疫缺陷病毒感染，排除自身免疫性、酒精性、藥物性、脂肪性等其他因素引起的肝損害，既往或近期未使用免疫抑制劑。

1.2 治療方法 參照2010年版《慢性乙型肝炎防治指南》給予恩替卡韋0.5 mg，每日1次口服。在達到HBV DNA低于檢測下限、ALT復常、HBeAg血清學轉(zhuǎn)換后，再鞏固至少1年(經(jīng)過至少2次復查，每次間隔6個月)仍保持不變、且總療程至少已達2年，可考慮停藥，但延長療程可減少復發(fā)[1]。

1.3 血清CD28、CTLA4和LAG3檢測方法 取對照組和CHB組治療前及治療后4、12、24、48周外周靜脈血，采用ELISA法檢測血清CD28、CTLA4和LAG3，操作步驟均嚴格按照試劑盒說明書進行。CD28 ELISA試劑盒購自美國MyBioSource公司，CTLA4和LAG3 ELISA試劑盒購自美國CLOUD-CLONE公司。

1.4 抗病毒療效判斷方法 取對照組和CHB組治療前及治療后4、12、24、48周外周靜脈血，采用乙肝病毒核酸定量檢測試劑盒(上?？迫A生物工程公司)和美國ABI-7300熒光PCR儀檢測HBV-DNA，其檢測下限為5.0E+02 IU/mL，低于該值為病毒學應答(VR)；采用美國雅培ARCHITECT i2000全自動電化學發(fā)光儀及配套試劑檢測乙肝標志物(HBV-M)五項，記錄HBeAg轉(zhuǎn)陰情況。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清CD28、CTLA4和LAG3水平比較 截至2017年4月，CHB組隨訪到24周時仍31例、48周時僅10例。CHB組治療前血清CD28、CTLA4和LAG3水平均低于對照組(P均<0.05)，治療48周血清CD28、CTLA4和LAG3水平均高于治療前(P均<0.05)，血清CD28和CTLA4水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，但血清LAG3水平低于對照組(P<0.05)。

表1 兩組血清CD28、CTLA4和LAG3水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與治療前比較，#P<0.05。

2.2 CHB患者恩替卡韋抗病毒效果 CHB患者治療4周時VR 7例(22.6%)、12周時21例(67.7%)、24周時27例(87.1%)、48周時10例(100%)，VR共27例。CHB患者治療4周時HBeAg轉(zhuǎn)陰0例、12周時10例(32.3%)、24周時13例(41.9%)、48周時9例(90.0%)，共轉(zhuǎn)陰13例。

2.3 CHB患者VR、HBeAg轉(zhuǎn)陰前后血清CD28、CTLA4和LAG3水平比較 CHB患者VR前血清CD28、CTLA4和LAG3水平分別為(5.67±3.81)ng/mL、(245.30±134.37)pg/mL、(2.98±0.82)ng/mL，VR后分別為(6.89±8.09)ng/mL、(303.29±254.32)pg/mL、(4.34±3.20)ng/mL，VR后血清LAG3水平較VR前升高(P<0.05)。CHB患者HBeAg轉(zhuǎn)陰前血清CD28、CTLA4和LAG3水平分別為(5.80±4.55)ng/mL、(231.24±132.65)pg/mL、(3.08±1.22)ng/mL，轉(zhuǎn)陰后分別為(7.34±9.09)ng/mL、(370.53±289.64)pg/mL、(4.95±3.66)ng/mL，轉(zhuǎn)陰后血清CTLA4、LAG3水平高于轉(zhuǎn)陰前(P均<0.05)。

3 討論

HBV感染后，首先激活機體的天然和適應性免疫系統(tǒng)，誘導一系列免疫反應，其中HBV特異性T細胞免疫反應是HBV感染轉(zhuǎn)歸的重要決定因素。T細胞的激活需要雙信號刺激：第一信號由T細胞表面受體-抗原肽-MHC分子復合物產(chǎn)生，該信號決定了T細胞抗原應答的特異性；第二信號由共刺激分子與其相應受體結(jié)合產(chǎn)生，調(diào)控著免疫應答的類型和強度[7]。CD28是T細胞活化過程中主要的正向調(diào)節(jié)共刺激分子，表達于T細胞膜上；其與配體B7結(jié)合，協(xié)同MHC-TCR-CD3產(chǎn)生雙信號，起著增強或放大免疫效應的作用。缺少B7/CD28共刺激信號，會導致抗原刺激的T細胞凋亡和抗原再刺激無反應。CTLA4、LAG3是T細胞活化過程中重要的負性共刺激分子，僅在T細胞接受抗原刺激后被誘導表達。CTLA4同樣也與B7配體結(jié)合，其表達量較CD28低，而親和力較CD28高。其主要功能為調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡，促進Th0細胞向Th1亞群分化[7]。LAG3是一種獨立的負調(diào)節(jié)分子，負性調(diào)控CD8+T細胞的增殖和功能，增強Treg細胞的抑制活性，同時還調(diào)控抗原提呈細胞的活性[8, 9]。研究[10]顯示，在慢性淋巴細胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒感染中，LAG3與慢性病毒感染導致的T細胞耗竭密切相關(guān)。文獻報道[4,11]，CHB患者外周血T細胞表面的CD28、CTLA4、LAG3存在表達異常。因此，本研究進一步闡述了抗病毒治療過程中血清CD28、CTLA4、LAG3動態(tài)變化情況。

本研究顯示，CHB患者血清CD28、CTLA4和LAG3水平均低于對照組。這與王琳等[12,13]的研究結(jié)果類似。其研究發(fā)現(xiàn)，CHB患者外周血CD4+CD28+和CD4+CTLA4+T細胞數(shù)量明顯下降，外周血單個核細胞中的CD28和CTLA4 mRNA表達量也明顯下降。共刺激分子是調(diào)節(jié)T細胞反應的重要分子，CD28促進Th2細胞分化，而CTLA4能抑制Th1細胞的分化[7, 14]。研究[15]表明，CHB患者的HBV特異性T細胞數(shù)量減少且功能下降。因此，上述究結(jié)果提示CHB患者的HBV特異性T細胞功能異?？赡芘c共刺激分子表達異常有關(guān)。王琳等[12]研究發(fā)現(xiàn)，抗病毒治療有效的CHB患者的CD8+CD28+T細胞數(shù)量高于未治療者。本研究進一步證實，抗病毒治療使CHB患者血清CD28、CTLA4和LAG3水平逐漸升高；尤其在治療48周后，血清CD28、CTLA4和LAG3水平升高明顯。上述結(jié)果表明，CHB患者血清CD28、CTLA4和LAG3水平與抗病毒治療之間密切相關(guān)。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)，抗病毒治療能夠明顯增強CHB患者HBV特異性細胞毒性T細胞(CTLs)的數(shù)量和功能，但其機制并不清楚[15]。結(jié)合本研究結(jié)果推測：高滴度的HBV可能抑制了CD28、CTLA4和LAG3等共刺激分子的表達，進而導致患者HBV特異性T細胞功能異常；而抗病毒治療直接降低了病毒載量，進而促進了共刺激分子的表達，最終促進了CHB患者HBV特異性T細胞功能恢復。

LAG3被認為是抑制性免疫分子，與T細胞免疫功能密切相關(guān)。關(guān)于LAG3在CHB患者中的表達情況的文獻不多，且結(jié)論不一。Ye等[11]發(fā)現(xiàn)，LAG3在CHB患者外周血CD8+T細胞上表達增多，且抑制其IFN-γ分泌能力。Kennedy等[16]研究發(fā)現(xiàn)，兒童CHB患者T細胞上的LAG3表達正常，并且較成人CHB患者的HBV特異性T細胞反應更強。而本研究顯示，CHB患者血清LAG3水平降低，且抗病毒治療后血清LAG3水平明顯增高。HBV感染不同疾病階段的特異性CTLs免疫功能存在明顯差異[17]，而LAG3表達情況與特異性CTLs免疫功能明顯相關(guān)[14]。因此，上述差異可能與不同研究中患者所處的疾病階段不同有關(guān)，也可能與標本類型不同有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，CHB患者發(fā)生VR后的血清LAG3水平較VR前升高，HBeAg轉(zhuǎn)陰后血清LAG3水平高于轉(zhuǎn)陰前。這提示LAG3可能具有預測疾病轉(zhuǎn)歸潛在價值，但還有待大樣本研究來進一步證實。

綜上所述，CHB患者血清CD28、CTLA4和LAG3水平降低，核苷類似物恩替卡韋抗病毒治療使其水平逐漸升高，其中血清LAG3水平與疾病轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)，可能具有預測疾病轉(zhuǎn)歸的潛在價值；然而，這些可溶性共刺激分子在免疫應答中具體的作用機制有待進一步研究。

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