王立巖，仝曉麗，赫東蕓，盛敏佳

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 婦產(chǎn)科，吉林 長春130033)

宮頸癌是最常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤。如何有效治療晚期宮頸癌，預(yù)防腫瘤的轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)，提高晚期宮頸癌患者的生存質(zhì)量并延長其生存期，是我們一直面臨的問題。來那度胺(Lenalidomide)屬于第二代免疫調(diào)節(jié)劑，具有免疫調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境、抗血管生成的作用。近年來，來那度胺用于治療前列腺癌、甲狀腺癌、肝癌、胰腺癌及腎癌等多種實體腫瘤的研究也已進(jìn)入臨床試驗階段[1]。部分臨床試驗結(jié)果顯示應(yīng)用來那度胺聯(lián)合化療藥物對于晚期惡性實體腫瘤進(jìn)行治療，減輕副反應(yīng)同時增強化療藥物對腫瘤的作用，在臨床上具有廣泛的應(yīng)用前景[2]。但是目前國內(nèi)、外對于來那度胺在宮頸癌治療中應(yīng)用的研究較少，而且來那度胺對于惡性實體腫瘤治療作用的具體機制目前尚不明確。本研究通過建立人宮頸癌小鼠移植模型，觀察來那度胺對小鼠宮頸癌腫瘤生長及腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，并進(jìn)一步探討來那度胺對宮頸癌腫瘤作用的機制。以期為臨床晚期宮頸癌治療方法提供新的切入點。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞、動物及主要試劑宮頸癌SiHa細(xì)胞購自ATCC細(xì)胞庫。NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)小鼠由美國俄克拉荷馬醫(yī)學(xué)研究中心提供。RPMI1640培養(yǎng)基、來那度胺購自美國Sigma公司，CCK試劑盒購自日本Dojindo公司，大鼠抗小鼠CD31抗體、大鼠IgG、驢抗大鼠AF488抗體及DMSO等購自美國Abcam公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)宮頸癌SiHa細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24 h換掖， 細(xì)胞融合度達(dá)90%時用0.25%含EDTA的胰酶消化貼壁的SiHa細(xì)胞，待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期用于實驗研究。

1.3CCK法體外檢測細(xì)胞生長抑制率取對數(shù)生長期的SiHa細(xì)胞接種于96孔板，每孔接種2×103細(xì)胞于100 μl培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h后，分組加藥處理。對照組(DMSO)及來那度胺組(濃度分別為0.01、0.1、1、10、100 μmol/L)每組設(shè)6個復(fù)孔，另設(shè)空白孔調(diào)零。藥物處理繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μl CCK溶液，37℃培養(yǎng)箱孵育4 h，于酶標(biāo)儀450 nm波長處測吸光值(A)，計算細(xì)胞生長抑制率IR=(1-實驗組A值/對照組A值)×100。

1.4建立小鼠人宮頸癌SiHa移植腫瘤模型及分組體外培養(yǎng)SiHa細(xì)胞傳代2-3次后，取2×106SiHa細(xì)胞懸浮于100 μl HBSS中，接種于4-6周齡NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠雙側(cè)背部皮下，觀察腫瘤生長情況。注射兩周后，小鼠皮下可觸及腫瘤時將小鼠隨機分為對照組及實驗組，每組6只。

1.5干預(yù)方法及腫瘤測量實驗組小鼠每日給予腹腔內(nèi)注射來那度胺(LEN 50 mg/kg)，對照組小鼠每日給予腹腔內(nèi)注射1%DMSO，共計21天。每隔3至5日卡尺測量小鼠皮下腫瘤長徑及短徑監(jiān)測腫瘤生長情況，三周后脫臼法處死小鼠，取皮下腫瘤組織，測量腫瘤長徑L，短徑W，并稱重腫瘤質(zhì)量。計算腫瘤體積V=L×W2/2。

1.6病理組織學(xué)檢查取各組小鼠腫瘤組織，常規(guī)固定、包埋、切片，HE染色后比較實驗組及對照組腫瘤組織形態(tài)學(xué)改變。取實驗組及對照組小鼠肝臟、肺及腦組織切片HE染色觀察腫瘤轉(zhuǎn)移情況。

1.7免疫熒光檢測取各組小鼠腫瘤組織行冰凍包埋，腫瘤組織冰凍切片行免疫熒光染色檢查，冰凍切片厚20 μm，切片溫度達(dá)室溫后，以4%PFA固定10 min，PBS清洗10 min共3次，以0.3% Triton X-100,3% 驢血清及3%BSA封閉切片，一抗大鼠抗小鼠CD31 4℃孵育過夜，PBS-T清洗10 min共3次，加入二抗驢抗大鼠AF488室溫孵育1 h，PBS-T清洗10 min共3次，4%PFA固定10 min，PBS清洗5 min共2次，封片后免疫熒光顯微鏡下觀察評估腫瘤組織內(nèi)血管生成情況。

2 結(jié)果

2.1來那度胺在體外對宮頸癌SiHa細(xì)胞生長的影響CCK-8法檢測結(jié)果顯示，不同濃度來那度胺體外作用于宮頸癌SiHa細(xì)胞48 h后，各組細(xì)胞生長無明顯差異，測得的A值分別與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；不同濃度來那度胺組間相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；不同濃度組間細(xì)胞生長抑制率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。來那度胺在體外對宮頸癌SiHa細(xì)胞生長無影響(圖1，表1)。

圖1 不同濃度來那度胺對SiHa細(xì)胞生長的影響

組別A值IR(%)對照組DMSO0.5998±0.0475—來那度胺組(μmol/L)0.010.5202±0.032213.28±5.370.10.6343±0.040915.76±6.8210.5728±0.094913.02±8.44100.5493±0.106815.16±11.301000.5737±0.079411.12±7.04

2.2來那度胺對小鼠人宮頸癌SiHa移植腫瘤的影響SiHa接種于4-6周齡NSG小鼠雙側(cè)背部皮下，注射兩周后可觸及腫瘤生長，實驗組小鼠每日給予腹腔內(nèi)注射來那度胺(50 mg/kg)，對照組小鼠每日給予腹腔內(nèi)注射1%DMSO，共21天。3周后脫臼法處死小鼠，取皮下腫瘤組織，測量腫瘤大小及重量。實驗結(jié)果顯示注射來那度胺組小鼠腫瘤體積190.2±34.31 mm3，對照組腫瘤體積440.7±65.1 mm3，實驗組腫瘤體積小于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；實驗組小鼠腫瘤重量為0.21±0.04 g，DMSO對照組腫瘤重量為0.40±0.09 g，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 來那度胺組及對照組腫瘤重量及體積比較

2.3小鼠移植腫瘤組織病理改變?nèi)庋塾^察來那度胺實驗組和DMSO對照組移植瘤均呈結(jié)節(jié)狀，切面呈灰黃色。來那度胺組移植瘤體積較小，界限清楚，易分離，切面局部可見壞死灶。鏡下觀察對照組癌細(xì)胞為典型核大深染細(xì)胞，瘤細(xì)胞成團排列，瘤細(xì)胞體積大，可見病理性核分裂相。來那度胺實驗組癌細(xì)胞可見局灶性壞死，細(xì)胞胞質(zhì)疏松，細(xì)胞核染色加深，可見核固縮、核溶解、核碎裂，染色質(zhì)部分呈紅染樣，見圖3。

圖3 小鼠SiHa移植腫瘤HE染色病理結(jié)果

2.4腫瘤組織內(nèi)血管生成情況免疫熒光顯微鏡下分別觀察實驗組及對照組腫瘤邊緣組織及腫瘤中心組織血管生成情況。結(jié)果顯示，對照組腫瘤中心組織內(nèi)新生血管數(shù)量為18.4±0.93，對照組腫瘤邊緣組織內(nèi)新生血管數(shù)量為19.4±1.36，實驗組腫瘤中心組織內(nèi)新生血管數(shù)量為9.8±0.8，實驗組腫瘤邊緣組織內(nèi)新生血管數(shù)量為10.8±1.46。與對照組相比，實驗組中腫瘤邊緣組織及腫瘤中心組織中CD31表達(dá)血管數(shù)量均明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。實驗組及對照組腫瘤邊緣組織內(nèi)新生血管數(shù)量均略高于腫瘤中心組織內(nèi)新生血管數(shù)量，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。

2.5病理組織學(xué)檢查腫瘤轉(zhuǎn)移情況取實驗組及對照組小鼠肝臟、肺及腦組織切片HE染色觀察腫瘤轉(zhuǎn)移情況。結(jié)果顯示，DMSO對照組小鼠肺組織內(nèi)可見腫瘤轉(zhuǎn)移灶，來那度胺實驗組小鼠肺組織內(nèi)未見明確轉(zhuǎn)移。見圖5。實驗組及對照組小鼠腦組織、肝臟組織內(nèi)均未見轉(zhuǎn)移病灶。

圖4 小鼠SiHa移植腫瘤組織中血管生成情況

圖5 小鼠肺組織HE染色病理結(jié)果

3 討論

近年來宮頸癌發(fā)病率增高，患者年輕化，雖然早期篩查及治療已取得明顯效果，但對于晚期宮頸癌的治療及預(yù)防晚期宮頸癌的轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)仍是研究的熱點。除放療外，新輔助化療已成為目前晚期宮頸癌綜合治療的主要方案之一。來那度胺目前在國內(nèi)外主要用于血液系統(tǒng)多發(fā)性骨髓瘤及骨髓增生異常綜合征的治療。但因其具有免疫調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境、抗血管生成等作用，現(xiàn)已在世界范圍內(nèi)應(yīng)用于多種實體腫瘤的抗腫瘤臨床試驗，并在前列腺癌、甲狀腺癌、肝癌及腎癌的聯(lián)合化療藥物治療中取得一定療效，但其具體機制尚不清楚[3-5]。來那度胺在宮頸癌治療中的應(yīng)用目前研究較少。本研究建立了小鼠人宮頸癌SiHa細(xì)胞移植腫瘤模型，通過體內(nèi)、外試驗研究，結(jié)果顯示來那度胺在體外對SiHa細(xì)胞生長無明顯抑制作用，但在體內(nèi)可抑制小鼠SiHa移植腫瘤的生長，并可抑制小鼠模型SiHa腫瘤肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生。

來那度胺是沙利度胺的衍生物，是一種新型免疫調(diào)節(jié)劑，具有抗腫瘤作用。對于其常用于的血液系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞而言，來那度胺通過活化凋亡蛋白酶caspase-8，啟動線粒體相關(guān)凋亡信號通路，增加細(xì)胞對Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡敏感性，下調(diào)NF-kB活性及下調(diào)凋亡蛋白抑制劑等機制誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到對血液系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞殺傷的作用[6-8]。而來那度胺對于實體腫瘤的抗腫瘤作用，主要通過免疫調(diào)節(jié)、抗新生血管生成及基因調(diào)節(jié)等發(fā)揮作用。近年來研究表明沙利度胺可通過直接抑制VEGF的表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移和黏附，抑制血管形成，給抗血管生成治療腫瘤帶來了希望。2014年P(guān)rasanth G等[9]研究發(fā)現(xiàn)利用來那度胺聯(lián)合索拉菲尼治療晚期癌癥患者有良好的耐受性，在黑色素瘤、腺樣囊性癌和卵巢腺癌患者中疾病穩(wěn)定≥6個月。另有研究[10]結(jié)果顯示沙利度胺能抑制人宮頸癌Hela細(xì)胞的生長，并呈現(xiàn)劑量依賴性，隨著沙利度胺濃度的增加，VEGF的表達(dá)呈不同程度的下降，抑制腫瘤細(xì)胞生長。本實驗中用CD31單克隆抗體標(biāo)記小鼠移植腫瘤組織中的血管，免疫熒光結(jié)果顯示來那度胺實驗組小鼠SiHa移植腫瘤組織中血管數(shù)量低于DMSO對照組腫瘤組織中血管數(shù)量。提示來那度胺在移植腫瘤小鼠體內(nèi)通過抗血管生成，在一定程度上抑制腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移。來那度胺的免疫調(diào)節(jié)作用表現(xiàn)在除了能抑制腫瘤壞死因子，白細(xì)胞介素的產(chǎn)生外，還能上調(diào)外周血單核細(xì)胞抗炎性因子，刺激T淋巴細(xì)胞分泌干擾素，活化自然殺傷細(xì)胞，增強NK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用[11，12]。本實驗結(jié)果顯示體外單純應(yīng)用來那度胺對SiHa細(xì)胞生長無明顯抑制作用，而在體內(nèi)來那度胺的應(yīng)用可明顯抑制腫瘤的生長，提示來那度胺的抗腫瘤作用與免疫調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境關(guān)系密切。

綜上所述，來那度胺在體外對人宮頸癌SiHa細(xì)胞生長無影響，對小鼠SiHa細(xì)胞移植腫瘤具有生長抑制作用，可減少移植腫瘤中血管生成，并對腫瘤的轉(zhuǎn)移起到一定抑制作用。提示來那度胺的抗腫瘤作用機制與抗腫瘤血管生成相關(guān)。本研究結(jié)果為臨床晚期宮頸癌綜合治療新方法的研究提供一定的理論依據(jù)。

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