李天嬌，張永杰，王子龍，劉 穎，梁 惠,*

丙烯酰胺（acrylamide，AM）是一種2A類致癌物，易溶于水，因此容易通過(guò)呼吸道、皮膚、消化道途徑吸收進(jìn)入動(dòng)物和人體。除了職業(yè)接觸外，食品、飲水、化妝品、香煙和衣物中都會(huì)含有丙烯酰胺，尤其是高溫加工的富含淀粉的食物。研究表明，丙烯酰胺會(huì)產(chǎn)生神經(jīng)毒性、遺傳毒性、生殖毒性及致癌性[1-2]，還會(huì)導(dǎo)致小腸結(jié)構(gòu)破壞。干酪乳桿菌（Lactobacillus casei，Lc）屬于益生菌的一種，能夠?qū)λ拗鳟a(chǎn)生有益作用。研究發(fā)現(xiàn)，干酪乳桿菌對(duì)腫瘤生長(zhǎng)具有一定的抑制效果[3]，可以提高機(jī)體抗氧化能力[4]，調(diào)節(jié)腸道菌群[5]，但是干酪乳桿菌能否改善丙烯酰胺誘導(dǎo)的腸道損傷的研究鮮有報(bào)道。因此，本研究以干酪乳桿菌為干預(yù)物，對(duì)大鼠小腸超微結(jié)構(gòu)、血漿D-乳酸（D-lactic acid，D-LA）和二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）水平以及腸道菌群進(jìn)行觀察和檢測(cè)，從而探討干酪乳桿菌對(duì)不同劑量丙烯酰胺誘導(dǎo)大鼠腸道損傷的保護(hù)效果。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

SPF級(jí)Wistar大鼠105 只，雄性，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK（魯）20140007。

活菌型乳酸菌乳飲品（干酪乳桿菌菌體濃度1×1011CFU/L） 天津養(yǎng)樂(lè)多乳品有限公司；D-LA和DAO酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 上海迪奧生物科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 德國(guó)QIAGEN公司。

1.2 儀器與設(shè)備

半自動(dòng)組織包埋機(jī) 英國(guó)Thermo Shandon公司；LKB-5超薄切片機(jī) 瑞典LKB公司；JEM1200EX透射電子顯微鏡 日本電子株式會(huì)社；ELx808型酶標(biāo)儀美國(guó)BioTek公司；BioPhotometer Plus6132型核酸蛋白檢測(cè)儀、Realplex4型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 德國(guó)Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組及給藥方法

105 只雄性Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為7 組：正常對(duì)照組，低、中、高劑量丙烯酰胺組（低、中、高劑量AM），干酪乳桿菌干預(yù)低劑量丙烯酰胺組（Lc+低劑量AM），干酪乳桿菌干預(yù)中劑量丙烯酰胺組（Lc+中劑量AM），干酪乳桿菌干預(yù)高劑量丙烯酰胺組（Lc+高劑量AM），每組15 只，每日給予充足的基礎(chǔ)飼料及飲水。按以下方法給藥：正常對(duì)照組，給予生理鹽水灌胃；低、中、高劑量丙烯酰胺組分別給予5、15、30 mg/（kg·d mb）丙烯酰胺灌胃；干酪乳桿菌干預(yù)低、中、高劑量丙烯酰胺組給予2.1×109CFU/（kg·d mb）乳酸菌飲品灌胃，同時(shí)分別給予5、15、30 mg/（kg·d mb）丙烯酰胺灌胃。實(shí)驗(yàn)周期為4 周。

1.3.2 標(biāo)本收集及指標(biāo)檢測(cè)

末次灌胃后，采用代謝籠收集各組大鼠糞便各3～5 粒，-80 ℃凍存?zhèn)溆?。禁?2 h后，60 mg/kg戊巴比妥鈉溶液麻醉，腹主動(dòng)脈取血，留取小腸組織，取距回盲瓣近心端5 cm處的回腸組織進(jìn)行固定用于觀察超微結(jié)構(gòu)，分離血漿，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 腸組織超微結(jié)構(gòu)觀察

將1 mm3腸組織用體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛溶液固定4 h，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）漂洗；體積分?jǐn)?shù)1%鋨酸溶液固定1 h，PBS漂洗；丙酮逐級(jí)脫水；環(huán)氧樹(shù)脂（EPONB12）包埋，溫箱固化。超薄切片機(jī)切片，厚度50～70 nm，3%醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色，透射電子顯微鏡觀察。

1.3.4 干酪乳桿菌對(duì)大鼠血漿中D-LA和DAO水平的影響

檢測(cè)方法按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，用酶標(biāo)儀測(cè)450 nm波長(zhǎng)處吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出D-LA和DAO水平。

1.3.5 干酪乳桿菌對(duì)大鼠腸道菌群的影響

標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA提取：分別將標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸桿菌、糞腸球菌、雙歧桿菌、乳桿菌、脆弱擬桿菌及柔嫩梭菌凍干粉溶于200 μL PBS中，采用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA，具體步驟嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作，-20 ℃保存。

PCR引物設(shè)計(jì)：參照文獻(xiàn)[6]設(shè)計(jì)大腸桿菌、糞腸球菌、雙歧桿菌、乳桿菌、脆弱擬桿菌及柔嫩梭菌等特異菌株16S rDNA引物序列，見(jiàn)表1。

表1 特異菌屬16S rDNA片段PCR擴(kuò)增引物序列及退火溫度Table 1 Species-specific 16S rDNA primer sequences and annealing temperatures for real-time PCR

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：將所得6 種標(biāo)準(zhǔn)菌株的DNA片段回收純化后作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)品，以核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定其濃度，換算為1 μL各標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。將各標(biāo)準(zhǔn)品以10 倍體積系列稀釋，使之成為l×107～1×102拷貝數(shù)/μL，作為標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行以SYBR Green為熒光染料的實(shí)時(shí)熒光定量PCR。反應(yīng)體系25 μL，其中dNTP 2.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，Taq酶0.5 μL，細(xì)菌基因組DNA模板2.0 μL（50 ng/μL）。反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃，15 min；變性95 ℃，10 s；最佳退火溫度（表1）20 s；延伸72 ℃，30 s；共50 個(gè)循環(huán)，反應(yīng)完畢后進(jìn)行溶解曲線分析。根據(jù)讀取的熒光數(shù)據(jù)，由系統(tǒng)軟件Mastercycler ep realplex自動(dòng)分析Ct值，并生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

待測(cè)樣品16S rDNA定量分析：將待測(cè)糞便樣品提取腸道菌群DNA后分別進(jìn)行6 種細(xì)菌的16S rDNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件與標(biāo)準(zhǔn)曲線制備時(shí)相同。每次實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品校正和ddH2O代替DNA模板的陰性對(duì)照，每個(gè)樣品均同時(shí)做2 個(gè)平行復(fù)孔。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用方差分析，組內(nèi)比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 干酪乳桿菌對(duì)小腸組織超微結(jié)構(gòu)的影響

圖1 大鼠小腸組織透射電子顯微鏡觀察Fig. 1 Transmission electron microscopic images of small intestine from rats

表2 干酪乳桿菌對(duì)大鼠小腸組織微絨毛長(zhǎng)度的影響Table 2 Effect of Lactobacillus casei on microvilli length in rats

由圖1和表2可知，正常對(duì)照組小腸微絨毛豐富，細(xì)胞間緊密連接，結(jié)構(gòu)清晰完整；與正常對(duì)照組相比，低劑量丙烯酰胺組小腸微絨毛長(zhǎng)度無(wú)明顯變化（P＞0.05），中、高劑量丙烯酰胺組小腸緊密連接腫脹，微絨毛排列稀疏，微絨毛長(zhǎng)度分別縮短了17.6%和36.2%，具有顯著性差異（P＜0.05）；干酪乳桿菌干預(yù)后，大鼠小腸微絨毛排列情況均得到不同程度的改善，緊密連接腫脹減輕，微絨毛長(zhǎng)度分別增長(zhǎng)了42.9%、50.1%和29.8%，具有顯著性差異（P＜0.05）。

2.2 干酪乳桿菌對(duì)大鼠血漿中D-LA和DAO水平的影響

表3 干酪乳桿菌對(duì)大鼠血漿中D-LA和DAO水平的影響Table 3 Effect of Lactobacillus casei on on plasma D-LA and DAO levels in rats from different groups

由表3可知，與正常對(duì)照組相比，中、高劑量丙烯酰胺組大鼠血漿中D-LA和DAO水平明顯升高（P＜0.05）；干酪乳桿菌干預(yù)后，大鼠血漿中D-LA和DAO水平顯著降低（P＜0.05）。

2.3 干酪乳桿菌對(duì)大鼠腸道菌群的影響

表4 干酪乳桿菌對(duì)大鼠腸道菌群的影響Table 4 Effect of Lactobacillus casei on intestinal microbiota in rats拷貝數(shù)/g

由表4可知，與正常對(duì)照組相比，中、高劑量丙烯酰胺組大鼠糞便中大腸桿菌和糞腸球菌的數(shù)量明顯升高（P＜0.05），雙歧桿菌和乳桿菌的數(shù)量明顯降低（P＜0.05），脆弱擬桿菌和柔嫩梭菌的數(shù)量無(wú)明顯變化（P＞0.05）；干酪乳桿菌干預(yù)后，大鼠糞便中大腸桿菌和糞腸球菌的數(shù)量均有不同程度的減少，雙歧桿菌和乳桿菌的數(shù)量均有不同程度增加，脆弱擬桿菌和柔嫩梭菌的數(shù)量無(wú)明顯變化（P＞0.05）。

3 討 論

自從2002年瑞典的研究人員首次在油炸、高溫烘烤的淀粉食品（如薯?xiàng)l、薯片等）中發(fā)現(xiàn)丙烯酰胺后[7]，這種化學(xué)物質(zhì)對(duì)人體的危害性引起了社會(huì)的高度關(guān)注。丙烯酰胺是一種中等毒性的親神經(jīng)毒物，水溶性強(qiáng)，易被生物體的消化道、皮膚、肌肉或其他途徑吸收，從而造成急性、亞急性或慢性中毒。研究人員發(fā)現(xiàn)，丙烯酰胺會(huì)對(duì)腸道功能造成影響，它可以誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞的氧化損傷[8]，破壞小腸絨毛的完整性[9]，降低小腸絨毛長(zhǎng)度、隱窩數(shù)量和小腸的吸收面積[10]。丙烯酰胺屬于脂肪族酰胺，可以在酰胺酶或酰胺水解酶的催化下進(jìn)行脫氨基作用，產(chǎn)生氨和丙烯酸。丙烯酸可以轉(zhuǎn)化為丙酸或者β-羥基丙酸、乳酸和CO2[11]。已有研究表明，一些腸道微生物可以產(chǎn)生酰胺酶[12]，那么，調(diào)節(jié)腸道微生物對(duì)因長(zhǎng)期攝入丙烯酰胺造成的腸道損傷是否具有改善作用值得人們深入研究。益生菌是一類能夠?qū)λ拗鳟a(chǎn)生有益作用的活體微生物，可以降低腸道通透性，保護(hù)腸黏膜屏障功能，調(diào)節(jié)腸道微生物[13-16]。2001年我國(guó)衛(wèi)生部發(fā)布了可用于保健食品的益生菌菌種名單，主要包括：雙歧桿菌類、乳桿菌類以及嗜熱鏈球菌。干酪乳桿菌屬于乳桿菌類，被廣泛應(yīng)用于乳制品中，具有抑制腫瘤生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、保護(hù)小腸黏膜、調(diào)節(jié)腸道菌群等多種有益作用[3-5]。因此，本研究選擇乳酸菌飲品（所含菌種只有干酪乳桿菌）作為干預(yù)物，探討干酪乳桿菌能否通過(guò)調(diào)節(jié)腸黏膜屏障功能和腸道菌群，改善丙烯酰胺所誘導(dǎo)的腸道損傷。

本研究通過(guò)丙烯酰胺灌胃的方法建立大鼠丙烯酰胺腸道損傷的模型。透射電子顯微鏡結(jié)果顯示，中、高劑量丙烯酰胺組小腸緊密連接腫脹，微絨毛排列稀疏，微絨毛長(zhǎng)度顯著縮短，說(shuō)明中、高劑量丙烯酰胺組已經(jīng)成功誘導(dǎo)了大鼠小腸組織損傷；而干酪乳桿菌干預(yù)后，大鼠小腸微絨毛排列情況均得到不同程度的改善，緊密連接腫脹減輕，微絨毛長(zhǎng)度顯著增長(zhǎng)，表明干酪乳桿菌對(duì)大鼠的小腸組織具有一定的保護(hù)作用。

血漿D-LA和DAO水平是監(jiān)測(cè)腸道屏障功能的重要指標(biāo)，它們可以很好地反映腸黏膜屏障的破壞程度。D-LA是由腸道菌群發(fā)酵而產(chǎn)生的代謝終產(chǎn)物；DAO是存在于哺乳動(dòng)物腸黏膜上皮絨毛中具有高度活性的細(xì)胞內(nèi)酶。研究表明，當(dāng)機(jī)體處于生理狀態(tài)時(shí)，血中的D-LA和DAO水平均較低。當(dāng)腸黏膜屏障受損時(shí)，大量的D-LA和DAO會(huì)通過(guò)腸黏膜釋放入血，從而導(dǎo)致血漿中D-LA和DAO水平升高[17-18]。本研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，中、高劑量丙烯酰胺組大鼠血漿中D-LA和DAO水平明顯升高，說(shuō)明中、高劑量丙烯酰胺會(huì)在一定程度上造成大鼠腸黏膜屏障破壞；干酪乳桿菌干預(yù)后，大鼠血漿中D-LA和DAO水平顯著降低，說(shuō)明攝入干酪乳桿菌可以修復(fù)大鼠腸黏膜屏障功能，改善丙烯酰胺造成的腸道損傷。

腸道菌群在維持腸道內(nèi)環(huán)境，保護(hù)腸道健康等方面起著重要的作用。在機(jī)體腸道中存在著大量的微生物，它們按照一定的數(shù)量和比例，對(duì)宿主發(fā)揮著許多重要的生理功能，這些微生物即腸道菌群。研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群可以調(diào)節(jié)能量水平和代謝，中和藥物和致癌物，調(diào)節(jié)腸動(dòng)力，調(diào)節(jié)免疫和屏障功能，防止病原體的入侵[19-21]。一旦發(fā)生腸道菌群失調(diào)，就會(huì)對(duì)許多疾病產(chǎn)生影響，尤其是一些腸道疾病，如潰瘍性結(jié)腸炎、結(jié)直腸癌、腸易激綜合征等[22-26]。已有研究表明，益生菌制劑可以調(diào)節(jié)腸道菌群[27]，其機(jī)制可能與它們所產(chǎn)生的抵抗致病物質(zhì)的維生素、抗氧化物以及防御素有關(guān)[28]，還可能與它們產(chǎn)生短鏈脂肪酸、降低毒性有關(guān)。許多益生菌屬于革蘭氏陽(yáng)性菌，不含脂多糖，比如雙歧桿菌和乳桿菌。這些菌種會(huì)與病原體競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或腸壁上的受體，從而減少感染的風(fēng)險(xiǎn)[29]。研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充益生菌可以增加乳桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量，減少大腸桿菌和糞腸球菌的數(shù)量，從而達(dá)到調(diào)節(jié)腸道內(nèi)環(huán)境的目的[30-31]。本研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，中、高劑量丙烯酰胺組大鼠糞便中大腸桿菌和糞腸球菌的數(shù)量明顯升高，雙歧桿菌和乳桿菌的數(shù)量明顯降低，脆弱擬桿菌和柔嫩梭菌的數(shù)量無(wú)明顯變化，說(shuō)明中、高劑量丙烯酰胺會(huì)造成一些腸道菌群的改變，影響腸道功能；經(jīng)干酪乳桿菌干預(yù)后，大鼠糞便中大腸桿菌和糞腸球菌的數(shù)量均有不同程度的減少，雙歧桿菌和乳桿菌的數(shù)量均有不同程度增加，脆弱擬桿菌和柔嫩梭菌的數(shù)量無(wú)明顯變化，說(shuō)明干酪乳桿菌可以調(diào)節(jié)大鼠的腸道菌群，保護(hù)腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。

綜上所述，長(zhǎng)期攝入一定量的丙烯酰胺會(huì)造成大鼠腸黏膜屏障破壞和腸道菌群改變，而補(bǔ)充干酪乳桿菌在一定程度上可以保護(hù)丙烯酰胺所誘導(dǎo)的腸道損傷，其機(jī)制可能與改善腸黏膜屏障功能，調(diào)節(jié)腸道菌群有關(guān)。這提示干酪乳桿菌在修復(fù)腸道損傷的研究中具有廣泛的應(yīng)用前景。

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