鄧蔡 張麗 冷衛(wèi)東 歷丹 桂婷

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心牙周科,湖北 十堰 442000)

牙周組織的再生一直以來都是口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，在再生過程中生長因子發(fā)揮了巨大的作用[1,2]。但由于生長因子易失活、易流失的特點(diǎn)，其應(yīng)用長期以來都受到了限制。近年來，隨著組織工程技術(shù)的飛速發(fā)展，不少理想的生物相容性的支架材料在臨床上得到了應(yīng)用[3-4]。注射性殼聚糖β-甘油磷酸鈉(chitosan/β-glycerol phosphate disodium salt，C/GP)是一種生理中性、在37℃時可形成凝膠的物質(zhì)，對大分子藥物具有緩釋性，能夠作為細(xì)胞的載體并維持細(xì)胞活性[5，6]。富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)富含生長因子，能夠從自體外周血中提取，故不存在免疫排斥反應(yīng)，在牙周組織再生中能夠發(fā)揮巨大作用[4]。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞((bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是一種理想的種子細(xì)胞，具有取材容易、增殖性強(qiáng)、易于成活等多種優(yōu)勢[7，8]。本研究將分析可注射性殼聚糖β-甘油磷酸鈉凝膠負(fù)載富血小板血漿和骨髓基質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)牙周再生的效果。

1 材料與方法

1.1 材料來源 取3只健康雄性雜種犬，年齡1～2歲，體重15～20kg。 試劑：醫(yī)用級殼聚糖(青島博益特生物材料有限公司提供，脫乙酰度91%)，β-甘油磷酸二鈉、牛凝血酶、胰蛋白酶(上海研生生化試劑有限公司)，優(yōu)純級乙酸(國藥集團(tuán))，胎牛血清(西安熱默爾生物科技有限公司)，DMEM培養(yǎng)液(美國Gibco)，人淋巴細(xì)胞分離液(深圳市偉通生物科技有限公司)。儀器：CO2培養(yǎng)箱(美國SHELLAB公司)，倒置顯微鏡(上海蔡康光學(xué)儀器廠)。

1.2 研究方法

1.2.1 C/GP溶液制備方法 于8ml 0.1mol/L的乙醇溶液中置入殼聚糖0.2g，使用攪拌器攪拌約2h。把0.56gβ-甘油磷酸鈉置于2ml雙蒸水中攪勻并振蕩5min。將上述兩種溶液進(jìn)行20min冰浴，而后把β-甘油磷酸鈉逐滴加入殼聚糖溶液并混勻攪拌10min。所得C/GP溶液的β-甘油磷酸鈉質(zhì)量濃度為5.6%，殼聚糖質(zhì)量濃度為2.0%。

1.2.2 PRP的制備 采集犬靜脈血10ml加入裝有1ml 10%枸櫞酸鈉抗凝劑的試管中，立刻采用二次離心法進(jìn)行PRP的制備，可獲得1ml PRP，置于-70℃冰箱中貯存。

1.2.3 BMSCs培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化 采集犬髂后上棘骨髓進(jìn)行BMSCs的原代培養(yǎng)，并對第三代BMSCs進(jìn)行誘導(dǎo)分化。

1.2.4 根分叉缺損模型的制備 將每只犬的上、下頜的第二、第三前磨牙與第一磨牙共10顆牙作為本次研究的實(shí)驗(yàn)牙，對3只犬分別注射0.1ml陸眠寧進(jìn)行麻醉。依據(jù)既往文獻(xiàn)[9,10]方法進(jìn)行前磨牙區(qū)Ⅱ度根分叉缺損制備，制備完畢后通過垂直褥式法對牙齦瓣進(jìn)行縫合。依據(jù)隨機(jī)分組結(jié)果對各組模型進(jìn)行相應(yīng)處置：A組僅在缺損處注射C/GP；B組在缺損處注射C/GP+PRP(C/GP：PRP=1:2)；C組在缺損處注射C/GP+106/m BMSCs；D組在缺損處注射C/GP+PRP+106/m BMSCs；對照組在缺損處不注射任何物質(zhì)。術(shù)后連續(xù)3天對犬進(jìn)行青霉素靜注以防感染，1周內(nèi)食用流質(zhì)食物，此后轉(zhuǎn)為半流質(zhì)食物。

1.2.5 標(biāo)本處理與組織學(xué)觀察 術(shù)后8周將實(shí)驗(yàn)犬處死，采集樣本用40g/L甲醛固定3天，常規(guī)脫鈣處理，制作5μm厚切片，每個組織隨機(jī)選取10個切片進(jìn)行觀察測量。在光學(xué)顯微鏡下對新生牙周組織部位的再生情況進(jìn)行觀察，并用微尺對新生牙骨質(zhì)、新生牙周膜組織、新生牙槽骨的新生情況進(jìn)行測定。同時，對各組牙周缺損再生情況進(jìn)行X線觀察。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 所有實(shí)驗(yàn)犬在術(shù)后均未發(fā)生異常癥狀，處死時均健康狀況良好。實(shí)驗(yàn)牙周邊未見牙石，牙齦部位愈合理想，深度約為1.2～1.7mm。

2.2 牙周缺損X線片觀察結(jié)果 觀察X線片可知，B、C、D組的牙周缺損部位均有明顯的牙槽再生現(xiàn)象，且骨密度均顯著高于A組與對照組。見圖1。

2.3 組織學(xué)觀察與測量結(jié)果 B組、C組及D組觀察鏡下均可見新生牙槽骨、新生牙骨質(zhì)和新生牙周膜纖維生長，D組牙周組織再生最為明顯，新生的牙槽骨幾乎充滿根分叉區(qū)。而A組與對照組的新生牙組織則較少，根分叉區(qū)存在大量上皮組織(見圖2)。結(jié)果顯示，B、C、D組的新生牙槽骨、新生牙骨質(zhì)和新生牙周膜纖維測量值均顯著高于A組和對照組(P<0.05)；D組各指標(biāo)值顯著高于B和C組(P<0.05)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；A組和對照組僅有少量的牙周組織再生，兩組差異不顯著(P>0.05)，見表1。

Table1Measurementsofalveolarbone,newcementumandperiodontalligamentfiberineachgroup

組別新生牙槽骨新生牙骨質(zhì)新生牙周膜纖維A組1.80±0.251.78±0.351.69±0.21B組4.22±0.29①4.16±0.30a①4.14±0.23①C組4.17±0.31①4.14±0.19①4.03±0.29①D組4.91±0.39①②4.79±0.26①②4.72±0.31①②對照組1.87±0.231.76±0.241.74±0.30

注：與A組、對照組相比，①P<0.05；與B組、C組相比，②P<0.05

3 討論

注射性殼聚糖β-甘油磷酸鈉(C/GP)作為新型的可注射性溫敏凝膠，生物相容性良好，目前已經(jīng)被作為種子細(xì)胞和生長因子載體在組織工程中被廣泛利用。有研究曾將C/GP作為支架材料，并負(fù)載髓核細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果顯示髓核細(xì)胞能夠正常增殖，且其中Ⅱ型膠原表達(dá)較高[11，12]。PRP是一種包含有多種生長因子的全血提取物，具有制備簡易、自體無毒等特點(diǎn)，是理想的生長因子來源。BMSCs則是一種未分化的原始祖細(xì)胞，有研究證明BMSCs能夠有效修復(fù)根分叉缺損，在牙骨質(zhì)、牙槽骨等組織的修復(fù)中起到重要作用[13，14]。

圖1各組術(shù)后8周牙周缺損X線片圖
Figure1X-rayfilmofperiodontaldefectat8weeksafteroperation

圖2 術(shù)后8周各組牙周缺損處牙周組織再生情況Figure 2 Periodontal tissue regeneration in periodontal defect at 8 weeks after operation注：A.對照組；B.C/GP；C.C/GP+PRP；D.C/GP+BMSCs ；E、F.C/GP+PRP+BMSCs

由于牙周炎造成的牙周組織缺損往往極不規(guī)則，選擇合適的支架材料與生長因子使缺損區(qū)得到充分的修復(fù)是當(dāng)前急需解決的問題[15，16]。本研究中所使用的C/GP在常溫下為溶液，可以向缺損區(qū)進(jìn)行注射使之充滿缺損部位，并通過原位凝固維持空間和釋放生長因子。結(jié)果顯示，A組與對照組牙槽雖出現(xiàn)了再生現(xiàn)象，但新生牙組織則較少，并且根分叉區(qū)存在大量上皮組織。這表明了C/GP能夠較好的與組織相容，且不會造成根分叉缺損部位的不良反應(yīng)，但同時C/GP也不會對牙周組織的再生起到促進(jìn)作用。既往文獻(xiàn)報(bào)道中，往往只研究了單一生長因子在牙周組織再生中發(fā)揮的作用，但單一生長因子由于不具有多生長因子聯(lián)用發(fā)揮協(xié)同作用的優(yōu)勢，因此效果并不理想[17，18]。本研究分析了C/GP+PRP+BMSCs 對牙周組織再生中的應(yīng)用效果，結(jié)果顯示B組、C組及D組均有新生牙槽骨、新生牙骨質(zhì)和新生牙周膜纖維生長，D組牙周組織再生最為明顯，且各指標(biāo)測量值均顯著高于A組、對照組(P<0.05)，D組各指標(biāo)值顯著高于B、C組(P<0.05)。這表明PRP的使用能夠有效提高牙周組織的再生與愈合，PRP與C/GP由于在液態(tài)時復(fù)合，因此復(fù)合更為均勻，保證了材料內(nèi)的PRP不會輕易經(jīng)血液沖刷等流失，能夠在缺損部位釋放高濃度的生長因子。D組的牙周組織再生最為顯著，這可能是由于C/GP在原位凝固后為BMSCs創(chuàng)造了一個立體增殖空間，再加之PRP中高濃度生長因子的釋放，BMSCs在牙周組織中的分化與增殖更為迅速。有研究表明，1%的PRP即可使BMSCs增殖速度加快，二者聯(lián)用能夠發(fā)揮良好的骨修復(fù)效果[19，20]。

4 結(jié)論

本文資料顯示，C/GP負(fù)載PRP和BMSCs有助于促進(jìn)牙周組織的再生，值得在臨床進(jìn)一步深入研究與利用。

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