許 潔 顏楠楠 趙傳祥 李 慈 吳 儀 肖騰飛 高鳳威 周文慧 邵啟祥 龍喬明夏 圣

(江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與免疫檢驗(yàn)學(xué)教研室， 鎮(zhèn)江 212013)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Endoplasmic reticulum，ER)是真核生物加工和折疊蛋白質(zhì)的重要場所[1]。在此過程中，葡萄糖的缺失、異常的Ca2+調(diào)節(jié)以及缺氧等都可以影響蛋白質(zhì)折疊，導(dǎo)致未折疊以及錯誤折疊的蛋白質(zhì)在腔內(nèi)聚集[2]，從而誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ER Stress)。錯誤折疊的蛋白質(zhì)不斷積累可以觸發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)。該反應(yīng)由三個內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜受體介導(dǎo)，即轉(zhuǎn)錄活化因子6(ATF6)、肌醇依賴酶1(IRE1)和蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)。UPR通過上調(diào)分子伴侶的表達(dá)、減少蛋白質(zhì)翻譯以及誘導(dǎo)ER相關(guān)降解作用(ER associated degradation，ERAD)，從而減輕腔內(nèi)的蛋白質(zhì)負(fù)荷[3-5]。

Sel1L(Suppressor/enhancer of Lin-12-like)是參與ERAD的E3連接酶羥甲基戊二?；€原酶降解蛋白1(Hrd1)的銜接蛋白。有研究表明，Sel1L基因與多種癌癥類型的腫瘤發(fā)生、干細(xì)胞分化、胰腺上皮細(xì)胞分化等有關(guān)[6-8]，而人類自身免疫性甲狀腺疾病和人類阿爾茲海默病中已鑒定出Sel1L基因的變異[9,10]。然而，Sel1L分子如何調(diào)控體內(nèi)ERAD和ER穩(wěn)態(tài)尚未清楚。

樹突狀細(xì)胞(Dendritic cell，DCs)是機(jī)體重要的抗原提呈細(xì)胞，在激發(fā)免疫應(yīng)答和誘導(dǎo)免疫耐受兩方面均起關(guān)鍵作用。其在分化和發(fā)育過程中，有大量蛋白質(zhì)的合成與折疊，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在這一過程中起到重要作用，而Sel1L分子是維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)所必不可少的。本研究即利用Cre-Loxp重組系統(tǒng)構(gòu)建CD11c+Sel1L基因敲除小鼠制備骨髓源樹突狀細(xì)胞，以探究Sel1L對樹突狀細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 Sel1Lf/f小鼠由蘇州大學(xué)龍喬明教授惠贈，CD11c-Cre+/-小鼠(JAX 007567)和H2-K b-OVA323-339肽抗原特異性的OTII小鼠(購自Jackson Lab)。實(shí)驗(yàn)時(shí)，由Sel1Lf/f小鼠與CD11c-Cre+/-小鼠進(jìn)行交配，產(chǎn)下子代小鼠的基因型經(jīng)基因型PCR鑒定后，篩選出Sel1Lf/fCD11c-Cre+/-小鼠。所有實(shí)驗(yàn)均使用6～12周齡的雌性小鼠，并用野生型同窩小鼠作對照組。

1.1.2主要試劑 RPMI1640 培養(yǎng)基、胎牛血清(PAA公司)，6孔、24孔、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Nunc公司)，總RNA提取試劑Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green熒光染料(TaKaRa公司)，脂多糖(LPS)、卵清蛋白(OVA)(Sigma公司)，CFSE熒光染料(Invitrogen公司)，RIPA裂解液、PMSF液(碧云天公司)，CD11c-Percp-cy5.5、CD11b-FITC、CD11b-PE、CD80-PE、CD86-PE、MHC-Ⅰ-FITC、MHC-Ⅱ-FITC、CD4-PE(eBioscience公司)，Biotin磁分選試劑盒(Stem cell公司)，兔抗Sel1L抗體(Abcam公司)，β-actin-HRP抗體(Santa Cruz公司)，BCA試劑盒(Thermo公司)；超凈工作臺(蘇州凈化廠)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo公司)，Western Blot系列設(shè)備、PCR儀、CFX96定量PCR儀(Bio-Rad公司)，倒置式生物顯微鏡(Nikon公司)，BD Accuri C6流式細(xì)胞儀、BD FACSCantoTMⅡ流式細(xì)胞儀(BD公司)。

1.2方法

1.2.1小鼠骨髓源樹突狀細(xì)胞(BMDCs)的體外培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行。將Sel1Lf/f型(WT)小鼠與Sel1Lf/fCD11c-Cre+/-型(KO)小鼠分別處死后，取出股骨與脛骨，用無菌PBS液沖洗骨髓腔，制備骨髓細(xì)胞。用含10%FCS、GM-CSF(10 ng/ml)、IL-4(1 ng/ml)的RPMI1640培養(yǎng)基將骨髓細(xì)胞在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)7 d后，收集并純化CD11c+細(xì)胞，作為未成熟BMDC細(xì)胞。經(jīng)LPS(終濃度1 μg/ml)刺激18 h細(xì)胞作為成熟BMDC細(xì)胞。

1.2.2Western blot檢測BMDCs中Sel1L蛋白的表達(dá) 分別將WT型與KO型小鼠誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d的BMDC細(xì)胞按每孔6×105細(xì)胞加入到24孔板中，加入LPS刺激后繼續(xù)培養(yǎng)18～24 h。收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液提取蛋白，Western blot檢測WT型與KO型小鼠BMDCs中Sel1L蛋白的表達(dá)。

1.2.3Sel1L對BMDCs膜表面共刺激分子和MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ的影響 BMDC細(xì)胞的處理與準(zhǔn)備同1.2.2。收集細(xì)胞，用大鼠血清封閉10 min后，4℃條件下，分別加入熒光素標(biāo)記MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、CD11c、CD80、CD86，孵育20 min。標(biāo)記完成后，將細(xì)胞用PBS洗2遍后，用流式細(xì)胞分析儀檢測標(biāo)記細(xì)胞的熒光信號，F(xiàn)lowjo軟件分析數(shù)據(jù)。

1.2.4ELISA法檢測上清中細(xì)胞因子的分泌 收集WT型與KO型小鼠的BMDCs的培養(yǎng)上清液。按照ELISA試劑盒(eBioscience)的使用說明分別檢測上清中IL-6、IL-12p70的含量。

1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量檢測Sel1L對BMDCs分泌IL-6、IL-12的影響 BMDC細(xì)胞的處理與準(zhǔn)備同1.2.2。收集細(xì)胞，加入TRIZOL裂解液提取其總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以β-actin為內(nèi)參，以cDNA為模板，定量檢測擴(kuò)增IL-6、IL-12基因的表達(dá)。所用引物序列如下：β-actin上游序列TGGCGCTTTTGACT-CAGGAT，下游序列GGGATGTTTGCTCCAACCAA；IL-6上游序列GAGGAGACTTCACAGAGGATAC，下游序列GACTCTGGCTTTGTCTTTCTTG；IL-12上游序列GGTTTGCCATCGTTTTG，下游序列 GGGTCTTTCCAGAGCCT。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR反應(yīng)體系：SYBR Premix EX TaqTMⅡ 5 μl、ddH2O 4.1 μl、上下游引物各0.2 μl、cDNA 0.5 μl，總反應(yīng)體系10 μl。擴(kuò)增條件為95℃ 5 s、58℃ 20 s、72℃ 31 s、39個循環(huán)。用2-ΔΔCT法計(jì)算相關(guān)基因表達(dá)。

1.2.6Sel1L對BMDCs激活抗原特異性CD4+T細(xì)胞增殖能力的評估 BMDC細(xì)胞的處理與準(zhǔn)備同1.2.2。將BMDCs用OVA323-339肽孵育6 h。取肽抗原特異性O(shè)T-Ⅱ小鼠脾臟，研磨、破紅后，用PBS洗一次。去上清，1 ml PBS重懸，將細(xì)胞數(shù)調(diào)整到1×108ml-1轉(zhuǎn)移至分選管中，補(bǔ)加PBS至總體積為1 ml。加試劑盒中FcR blocker 10 μl，加Biotin抗體6 μl，室溫15 min；加Biotin Selection Cocktail 100 μl，室溫15 min；加Magnetic Particles 50 μl，室溫 10 min；補(bǔ)加分選緩沖液至分選管總體積2.5 ml，混勻，將分選管插入分選磁鐵中，室溫5 min，棄去液體；加緩沖液混勻，再重復(fù)分選2次。加PBS吹打混勻細(xì)胞，加CFSE(終濃度2.5 μmol/L)于37℃避光孵育10 min。將經(jīng)OVA孵育的BMDCs用PBS洗1次后，與來自O(shè)T-Ⅱ TCR轉(zhuǎn)基因小鼠的CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)，二者比例為2×104∶ 2×105，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)4 d后，用熒光抗體CD4-PE標(biāo)記細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測T細(xì)胞的增殖情況。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 6.0軟件分析處理。兩組之間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1Sel1Lf/fCD11c-Cre+/-小鼠BMDCs中Sel1L的表達(dá) 如圖1所示，在未成熟BMDCs中，KO型小鼠相對于WT型小鼠來說，Sel1L基因幾乎不表達(dá)，而成熟BMDCs中趨勢更明顯。說明Sel1Lf/fCD11c-Cre+/-小鼠體內(nèi)Cre重組酶與Sel1L基因loxp位點(diǎn)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了Sel1L基因的條件性敲除。

2.2Sel1L對BMDCs增殖效率的影響 從圖2的結(jié)果可以看出，相對于WT型小鼠，KO型小鼠的CFSE的熒光強(qiáng)度右移，但細(xì)胞總數(shù)并沒有明顯差異，說明Sel1L的缺失導(dǎo)致BMDCs的分化增殖效率降低。

2.3Sel1L對BMDCs細(xì)胞膜表型的影響 值得注意的是，我們發(fā)現(xiàn)在未成熟BMDCs的表面上MHC-Ⅰ輕微升高，而MHC-Ⅱ表達(dá)則顯著降低。用LPS誘導(dǎo)18 h以后，導(dǎo)致WT型BMDCs中MHC-Ⅱ表達(dá)明顯增加，但未能升高KO型DC中的MHC-Ⅱ的表達(dá)。相比之下，MHC-Ⅰ依舊輕微上調(diào)，而CD80、CD86的表達(dá)水平并未被Sel1L缺失所改變(如圖3)。這表明小鼠中Sel1L的缺失導(dǎo)致BMDCs的MHC-Ⅱ的表達(dá)下降。

2.4Sel1L對BMDCs細(xì)胞分泌IL-6、IL-12的影響 對未成熟BMDCs與成熟BMDCs進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，LPS刺激后的成熟DCs分泌更高水平的炎性因子，與此同時(shí)，來自KO型小鼠的BMDCs，IL-6以及IL-12p70的mRNA水平明顯升高(圖4A)。另外，我們又收集了各組DCs的上清液，用ELISA的方法檢測了IL-6、IL-12p70的表達(dá)水平，從而在蛋白水平上進(jìn)一步驗(yàn)證了這一結(jié)果。

2.5Sel1L增強(qiáng)BMDCs細(xì)胞激活抗原特異性CD4+T細(xì)胞的增殖 DCs是專職抗原提呈細(xì)胞，通過MHC分子與T細(xì)胞表面受體相結(jié)合，將抗原呈遞給T細(xì)胞，產(chǎn)生T細(xì)胞活化信號，進(jìn)而誘導(dǎo)其增殖分化。為進(jìn)一步探究Sel1L的缺失對DCs這一功能的影響，我們將OVA323-339抗原特異性CD4+T細(xì)胞進(jìn)行CFSE標(biāo)記后，與OVA323-339孵育的成熟BMDCs共培養(yǎng)，分析CD4+T細(xì)胞的CFSE熒光強(qiáng)度從而反映CD4+T細(xì)胞的增殖情況。當(dāng)與WT型小鼠BMDCs共培養(yǎng)時(shí)，OT-Ⅱ小鼠的CD4+T細(xì)胞大量增殖。相反，與KO型小鼠的BMDCs共培養(yǎng)時(shí)，OT-Ⅱ小鼠的CD4+T細(xì)胞增殖減少。因此，DC中Sel1L基因缺失會削弱CD4+T細(xì)胞的激活。見圖5。

圖1 在樹突狀細(xì)胞中敲除Sel1L基因Fig.1 Targeted disruption of Sel1L gene in DCs

圖2 Sel1L基因?qū)MDCs增殖的影響Fig.2 Effects of Sel1L gene on proliferation of BMDCsNote:Data were shown as significance.

圖3 Sel1L基因?qū)MDCs細(xì)胞膜表型的影響Fig.3 Effects of Sel1L gene on phenotype of BMDCs

圖4 Sel1L基因?qū)MDCs細(xì)胞因子的影響Fig.4 Effects of Sel1L gene on BMDCs cytokines secretionNote:Data were shown as significance.

圖5 Sel1L基因?qū)MDCs激活抗原特異性CD4+T細(xì)胞增殖能力的影響Fig.5 Effects of Sel1L gene on capability of BMDCs in priming OVA specific CD4+T cell proliferation

3 討論

多種細(xì)胞應(yīng)激可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙，并最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)折疊能力和蛋白質(zhì)折疊負(fù)荷之間的不平衡。有報(bào)道認(rèn)為，蛋白質(zhì)的異常折疊與糖尿病、心肌缺血、心臟肥大、動脈粥樣硬化以及心力衰竭等有關(guān)[12-14]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以通過ERAD，負(fù)責(zé)識別和易位內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的末端錯誤折疊或未折疊的蛋白，將其靶向胞質(zhì)蛋白酶體降解。已有文獻(xiàn)報(bào)道Sel1L在哺乳動物ERAD和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)中具有不可或缺的作用[15,16]。我們的研究表明Sel1L缺失能降低BMDCs誘導(dǎo)分化過程中的增殖效率，并顯著降低MHC-Ⅱ的表達(dá)。有研究顯示ER跨膜E3泛素連接酶Hrd1通過促進(jìn)BLIMP1泛素化和降解，進(jìn)而增強(qiáng)MHC-Ⅱ表達(dá)[16]。BLIMP1是一種IFN-β基因的轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白，是分化效應(yīng)CD8+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞記憶應(yīng)答所必需的[17]，并且在經(jīng)LPS刺激的BMDCs中顯著表達(dá)，在DCs存活中起重要作用[18]，但Sel1L作為Hrd1的銜接蛋白是否是通過此途徑調(diào)節(jié)MHC-Ⅱ的表達(dá)尚不清楚。同時(shí)我們數(shù)據(jù)顯示Sel1L的缺失能上調(diào)MHC-Ⅰ的表達(dá)，有研究認(rèn)為，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯誤折疊的MHC-Ⅰ能被Sel1L-Hrd1復(fù)合物識別并催化[19]，這與我們的結(jié)果相符。因此，Sel1L可能選擇性調(diào)節(jié)MHC-Ⅱ的表達(dá)，并降解BMDCs中錯誤折疊的MHC-Ⅰ。

DC是專職抗原呈遞細(xì)胞，在固有免疫和適應(yīng)性免疫中發(fā)揮重要作用。在成熟過程中，DCs上調(diào)共刺激分子以及MHC-Ⅱ類分子，從而可以有效地將抗原呈遞給初始T細(xì)胞。此外，成熟的DC產(chǎn)生和分泌促炎細(xì)胞因子和趨化因子來吸引和激活先天效應(yīng)細(xì)胞，并誘導(dǎo)特定輔助性T細(xì)胞(Th)亞群的發(fā)育[20,21]。在DC抗原提呈的過程中，有大量蛋白質(zhì)的合成與折疊，而錯誤折疊的多肽則保留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，并被ERAD機(jī)制識別和逆轉(zhuǎn)錄。哺乳動物具有許多ERAD復(fù)合物，其中Sel1L-Hrd1復(fù)合物是最具保守性和生物化學(xué)特征的。本實(shí)驗(yàn)表明當(dāng)DC細(xì)胞缺失Sel1L基因時(shí)，其抗原遞呈能力受到抑制，分泌因子的能力上調(diào)。IRE1α在多種細(xì)胞類型中作為Sel1L-Hrd1 ERAD復(fù)合物的內(nèi)源性底物，其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在腸道炎癥以及腫瘤疾病中起到重要作用[22,23]，但Sel1L基因究竟是通過哪種分子機(jī)制影響DC細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用，還需后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

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