李文麗 余 鵑 向軍儉 王 宏

(暨南大學生命科學技術(shù)學院生物工程學系,廣州 510632)

《中國心血管病報告2016》報告，占城鄉(xiāng)居民總死亡原因首位的是心血管病，其中農(nóng)村為45.01%，城市為42.61%。急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)是冠心病的一種類型，隨著我國社會發(fā)展，飲食結(jié)構(gòu)的改變，生活節(jié)奏加快，急性心肌梗死已經(jīng)呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，發(fā)病越來越年輕化，并且男性發(fā)生的概率高于女性[1]。

現(xiàn)代醫(yī)學上檢測急性心肌梗死有三個標準，缺血性胸痛病史、心電圖特征性改變和血清中心肌標志物濃度的變化[2]。由于心肌肌鈣蛋白I(human cardiac troponin I ，cTnⅠ)在心肌受損時才在血液中出現(xiàn)，并且出現(xiàn)時間早，持續(xù)時間久，特異性強(持續(xù)時間>96 h)，因此國際臨床化學聯(lián)盟(IFCC)、美國臨床生化學會(NACB)和中華醫(yī)學檢驗分會等權(quán)威機構(gòu)已將cTnⅠ作為AMI診斷的“金標準”[3，4]。

心肌肌鈣蛋白Ⅰ、心肌肌鈣蛋白T和心肌肌鈣蛋白C三者形成三聚體復合物[5]。研究發(fā)現(xiàn)，當心肌發(fā)生損傷，外周血中90%的cTnⅠ以cTnⅠ-C或cTnⅠ-T-C復合物存在，單體形式存在較少[6]。因此建立能夠檢測以不同形式存在的cTnⅠ的檢測方法是必要的。本研究在前期成功獲得2株識別不同cTnⅠ表位的基礎(chǔ)上，建立可以檢測以cTnⅠ單體、cTnⅠ-C和cTnⅠ-T-C復合物形式存在的cTnⅠ的魯米諾化學發(fā)光酶免疫分析法，具有更高的實用性。

1 材料與方法

1.1實驗材料 人源的cTnⅠ-T-C抗原購自芬蘭Hytest公司；雌性BALB/c小鼠：6周齡，清潔級，購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心；cTnⅠ、cTnⅠ-C本實驗室表達；弗氏不完全佐劑購自Sigma公司；胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基購自Gibco；HRP標記羊抗鼠IgG二抗購自KPL公司；HRP標記試劑盒(A型)購自北京泰天河生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自Thermo Fisher公司；患者血漿樣本取自華僑醫(yī)院檢驗科，其中陽性樣本22例，陰性樣本8例。

1.2實驗方法

1.2.1細胞的復蘇 從實驗室液氮中取出分泌Ab1、Ab3的細胞株7D2和7H4，浸沒于的37℃水中快速搖晃，待凍存管中的細胞融化后，將細胞懸液加入裝有10 ml左右RPMI1640無血清培養(yǎng)基的離心管中，1 000 r/min離心7 min，棄上清，加入適量含血清培養(yǎng)基，用移液槍重懸后置于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱，4 h后換液。

1.2.2抗體亞型鑒定 采用SBA Clonotyping System-HRP試劑盒對Ab1和Ab3進行亞型鑒定。

1.2.3腹水型單克隆抗體的制備 采用小鼠體內(nèi)誘生法來制備腹水型單抗。

1.2.4單克隆抗體的純化 硫酸銨可以沉淀粗制品中的絕大部分蛋白，從而起到蛋白質(zhì)的初步純化作用。為此，常將硫酸銨沉淀法作為初步分離免疫球蛋白的粗純手段[7]。飽和硫酸銨沉淀法粗純之后用Protein G親和層析柱進行純化。

1.2.5單克隆抗體純化效果的鑒定 純化后的單克隆抗體經(jīng)BCA蛋白濃度試劑盒測定其濃度，經(jīng)SDS-PAGE法鑒定其蛋白純度。

1.2.6間接ELISA法鑒定單克隆抗體特異性 碳酸鹽包被液稀釋人源的cTnⅠ-T-C、cTnⅠ和cTnⅠ-C抗原0.5 μg/ml，孵育之后PBS-T緩沖液洗滌3次，再用5%的脫脂奶粉封閉，PBS-T緩沖液洗滌3次。將純化之后的單克隆抗體用PBS緩沖液從一定的倍數(shù)進行倍比稀釋，孵育之后PBS-T緩沖液洗滌3次。將羊抗鼠IgG用PBS-T稀釋至8 000倍，孵育之后PBS-T緩沖液洗滌5次，每孔加入TMB底物顯色液，室溫避光靜置反應(yīng)10 min后每孔加入50 μl 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，酶標儀讀取OD450nm吸光度數(shù)值，分析數(shù)據(jù)。

1.2.7抗體親和常數(shù)的測定 根據(jù)G.P.S.Raghava的方法，通過非競爭酶免疫實驗做出的親和力測定曲線，利用公式Ka =(n-1)/2(n[Ab']t-[Ab]t)計算親和常數(shù)Ka值。

1.2.8建立檢測人心肌肌鈣蛋白Ⅰ(cTnⅠ)魯米諾化學發(fā)光酶免疫分析方法 (1)捕獲抗體濃度的選擇 檢測抗體濃度不變，將捕獲抗體濃度和cTnⅠ-T-C抗原濃度梯度稀釋，分析捕獲抗體濃度對檢測靈敏度的影響，選擇最佳的捕獲抗體濃度。用碳酸鹽包被液稀釋Ab3至2、1、0.5、0.25 μg/ml，每孔加100 μl，4℃過夜。加200 μl 5%脫脂奶粉封閉2 h。分別稀釋cTnⅠ-T-C抗原至400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125 ng/ml 37℃孵育1 h。分別加入100 μl按照1∶1 000稀釋的HRP-Ab1，孵育1 h。分別加入50 μl 魯米諾A、B顯色液，顯色10 min。酶標儀讀取吸光度數(shù)值ODLum，分析數(shù)據(jù)。

(2)檢測抗體濃度的選擇 以最適的抗體濃度包被化學發(fā)光酶標板，將cTnⅠ-T-C抗原濃度梯度稀釋，以選擇最適的檢測抗體濃度。用碳酸鹽包被液稀釋Ab3至1 μg/ml，每孔加100 μl，4℃過夜。加200 μl 5%脫脂奶粉封閉2 h。分別稀釋cTnⅠ-T-C抗原至400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125 ng/ml，每孔100 μl，37℃孵育1 h。檢測抗體分別稀釋500倍、1 000倍、2 000倍，每孔100 μl，37℃孵育1 h。分別加入50 μl 魯米諾A、B顯色液，顯色10 min。酶標儀讀取吸光度數(shù)值ODLum，分析數(shù)據(jù)。

(3)標準曲線的建立 固定捕獲抗體Ab3和檢測抗體Ab1-HRP的濃度，以抗原濃度為橫坐標，以發(fā)光信號值為縱坐標，建立標準曲線。

(4)魯米諾化學發(fā)光酶免疫分析方法對cTnⅠ-T-C、cTnⅠ、cTnⅠ-C三種存在形式的抗原的檢測 固定捕獲抗體Ab3和檢測抗體Ab1-HRP的濃度，以抗原摩爾濃度為橫坐標，以發(fā)光信號值為縱坐標，建立檢測方法。

1.2.9臨床樣本的處理 采用臨床 UniCel DxI 800儀器為金標準，對從醫(yī)院收集的30例臨床血漿進行檢測分析，將兩種方法的結(jié)果進行比較。用磷酸鹽緩沖液將血漿作5倍稀釋處理，取100 μl每孔加入于96孔酶聯(lián)板中進行檢測。

1.3統(tǒng)計學處理 本實驗的數(shù)據(jù)通過GraphPad Prism 6 做圖軟件處理。數(shù)據(jù)組之間采用SPSS軟件進行分析。

2 結(jié)果

2.1腹水型單克隆抗體純化后蛋白濃度的測定和純度的鑒定 通過BCA蛋白濃度檢測試劑盒，BSA標準試劑濃度為縱坐標，對應(yīng)的OD570值為橫坐標建立蛋白質(zhì)濃度標準曲線，得出擬合公式y(tǒng)=0.000 8x+0.063，將Ab1和Ab3的OD570值代入擬合公式得到：Ab1濃度為13.558 mg/ml， Ab3濃度為8.7 mg/ml。經(jīng)過SDS-PAGE蛋白凝膠電泳鑒定Ab1和Ab3純度，結(jié)果顯示(圖1)，抗體重鏈和輕鏈的相對分子質(zhì)量分別在50 kD和25 kD附近，未見明顯雜帶，純化效果良好。

2.2兩株單克隆抗體效價的測定 經(jīng)過飽和硫酸銨粗純和親和層析Protein G柱純化之后，包被人源的cTnⅠ-T-C抗原間接ELISA檢測抗體效價，Ab1效價為1∶80萬，抗體Ab3效價為1∶40萬(圖2)。

2.3最佳配對抗體的親和常數(shù)測定 Ab1的親和常數(shù)為1.62×109L/mol，Ab3的親和常數(shù)為2.60×108L/mol(圖3)。

圖1 SDS-PAGE檢測抗體的純度Fig.1 SDS-PAGE tests purity of antibodiesNote:M.Protein marker;1.Ab1;2.Ab3.

圖2 抗體的效價測定Fig.2 Determination of monoclonal antibody titer

2.4cTnⅠ和cTnⅠ-C鑒定兩株抗體 用間接ELISA試驗鑒定三株抗體是否能夠結(jié)合cTnⅠ另外兩種形式：cTnⅠ單體和cTnⅠ-C復合物。由圖4可得兩株抗體均能和cTnⅠ單體和cTnⅠ-C復合物結(jié)合。

2.5建立人心肌肌鈣蛋白Ⅰ魯米諾化學發(fā)光酶免疫分析法 在魯米諾化學發(fā)光酶免疫分析法中，如果包被的抗體濃度過高，會浪費抗體，而且會造成非特異性結(jié)合；濃度過低，靈敏度會下降。因此需要對捕獲抗體和檢測抗體進行工作濃度的優(yōu)化。

2.5.1捕獲抗體濃度和檢測抗體濃度的優(yōu)化 包被抗體的濃度分別為2、1、0.5、0.25 μg/ml。當抗體濃度為1 μg/ml時，曲線變化明顯，檢測范圍廣，靈敏度高。確定最佳捕獲抗體Ab3濃度為1 μg/ml(圖5)。檢測抗體(濃度為1.25 μg/μl)分別稀釋500倍、1 000倍、2 000倍。當檢測抗體稀釋1 000倍時，檢測靈敏度比另外兩個稀釋倍數(shù)下檢測的靈敏度高，因此HRP-Ab1最佳工作濃度為稀釋1 000倍(圖6)。

圖3 抗體親和常數(shù)測定的曲線Fig.3 Curve of antibodies affinity constantNote:A.The curve of Ab1 affinity constant; B.The curve of Ab3 affinity constant.

圖4 兩株抗體與不同形式抗原的反應(yīng)Fig.4 Reaction between two antibodies and different antigens

2.5.2標準曲線 固定捕獲抗體Ab3的包被濃度為 1 μg/ml，固定檢測抗體Ab1-HRP濃度為稀釋1 000倍，以抗原濃度為橫坐標，以發(fā)光信號值為縱坐標，建立標準曲線(圖7)。標準曲線方程為y=423.6x-1 36，R2=0.998。確定檢測范圍6.25～400 ng/ml。

圖5 捕獲抗體工作濃度的優(yōu)化Fig.5 Optimizing working concentration of capture antibody

圖6 檢測抗體工作濃度的優(yōu)化Fig.6 Optimizing working concentration of detect antibody

2.6魯米諾化學發(fā)光酶免疫分析方法對cTnⅠ-T-C、cTnⅠ、cTnⅠ-C三種存在形式的抗原的檢測 見圖8。

2.7臨床樣本的檢測結(jié)果 用魯米諾化學發(fā)光酶免疫分析法對30例臨床血漿樣本進行檢測。以抗原濃度3.862 ng/ml為判斷陰陽性的cutoff值。自制配對抗體(Ab3/Ab1-HRP)檢測結(jié)果和臨床 UniCel DxI 800儀器檢測結(jié)果進行比較，統(tǒng)計分析準確率。檢測結(jié)果如表1、2所示，22份陽性樣本(表1中序號1～22號)，有5個弱陽性的樣本檢測結(jié)果為陰性，陽性樣本檢出率為77.3%，陰性樣本檢出率為100%。

2.8統(tǒng)計學分析結(jié)果 本實驗建立方法與對照方法結(jié)果進行比較，采用SPSS軟件分析，得到回歸方程：y=1.019x-1.533，R2=0.994，P=0.9016>0.05 說明兩組檢測值具有高度線性相關(guān)性，差異無顯著統(tǒng)計學意義，可以為臨床樣本檢測提供參考(圖9)。

圖7 人心肌肌鈣蛋白Ⅰ魯米諾化學發(fā)光酶免疫分析標準曲線Fig.7 Standard curve of human cardiac troponin Ⅰ chemiluminescence enzyme immunoassay

表1兩種檢測方法所測的血漿cTnⅠ濃度/(ng/ml)的比較

Tab.1ComparisonofplasmacTnⅠconcentration/(ng/ml)measuredbytwodetectionmethods

MethodsPlasmasamples123456789101112131415UniCelDxl8002966274506700849304252647159622512660138281655517513230822361328224Ab3/Ab1?HRP3540357335923714379862806353703211316118341563217489217632211928182MethodsPlasmasamples123456789101112131415UniCelDxl800341764750355998641539683410448712023501960218025902730281028502860291Ab3/Ab1?HRP375074478756334671869219511048711746535323590360436273705381538403848

圖8 檢測cTnⅠ-T-C、cTnⅠ、cTnⅠ-C三種存在形式Fig.8 Detection of cTnⅠ-T-C,cTnⅠ and cTnⅠ-C

表2臨床樣本檢測結(jié)果

Tab.2Resultofclinicalsamplesdetection

ItemsPositiveplasmasNegativeplasmasPositiverateNegativeratePlasmasamples228Ab3/Ab1?HRP178773%100%UniCelDxI800218955%100%

圖9 兩種檢測方法相關(guān)性分析Fig.9 Correlation analysis of two detection methods

3 討論

當心肌細胞因缺血或缺氧受到損傷時，心肌細胞內(nèi)的cTnⅠ釋放入血，外周血中的cTnⅠ主要以cTnⅠ-C或cTnⅠ-T-C復合物存在，復合物的形式使得cTnⅠ穩(wěn)定存在，不易被降解。本研究建立的魯米諾化學發(fā)光酶免疫分析檢測方法可以同時檢測不同形式的cTnⅠ，可以避免出現(xiàn)漏檢的情況，且魯米諾試劑靈敏度高，方法操作簡單，非常適合AMI的快速檢測。

研究證明，正常情況下外周血cTn濃度0.02～0.13 ng/ml，大于 0.2 ng/ml為臨界值，超過0.5 ng/ml 可以診斷AMI[5]。本實驗確定檢測范圍是 6.25～400 ng/ml，靈敏度有待提高。后續(xù)需要制備高親和力的針對cTnⅠ單抗，可以對免疫原進行優(yōu)化。cTnⅠ不穩(wěn)定，容易降解，免疫原性差，本實驗室可利用Discovery Studio軟件，結(jié)合NCBI和IEDB等數(shù)據(jù)庫提供的數(shù)據(jù)并分析cTnⅠ蛋白β轉(zhuǎn)角、柔性、抗原性和親水性[8]，從而預(yù)測cTnⅠ-T-C復合物的cTnⅠ亞基上的特異性抗原表位，選擇cTnⅠ上的氨基酸序列分別偶聯(lián)載體蛋白以形成抗原肽，生物信息學方法預(yù)測優(yōu)勢表位用于蛋白質(zhì)功能鑒定已十分普遍[9]。一般所選取的肽段具有位于抗原表面、結(jié)構(gòu)為簡單的Loop結(jié)構(gòu)、肽段的兩端暴露在蛋白表面、長度在8～20個氨基酸殘基等特點。獲得的高親和力抗體之后采用靈敏度更高的檢測方法，可采用夾心免疫放射法和膠體金免疫層析法，靈敏度分別可達0.35、0.4 ng/ml[10,11]。

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