夏小慧，王卉，張社平，夏惠蕓

1.蘭州城市學(xué)院體育學(xué)院，甘肅蘭州市730070；2.井岡山大學(xué)體育學(xué)院，江西吉安市343009；3.國(guó)營(yíng)長(zhǎng)風(fēng)機(jī)器廠職工醫(yī)院，甘肅蘭州市730070

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)是一種代謝型疾病，發(fā)病與遺傳和環(huán)境密切相關(guān)。闡明T2DM易感基因及其與環(huán)境因素、生活因素的相互作用機(jī)制，是科學(xué)防治T2DM的重要前提。

糖尿病前期又稱糖調(diào)節(jié)受損，是從糖代謝正常發(fā)展為T2DM的過渡階段，也是可以逆轉(zhuǎn)糖尿病發(fā)生的階段。在這一階段采取有效干預(yù)措施，對(duì)預(yù)防糖尿病具有重要意義。

運(yùn)動(dòng)干預(yù)是防治糖尿病的重要非藥物手段。目前運(yùn)動(dòng)干預(yù)的方式主要有有氧運(yùn)動(dòng)和抗阻運(yùn)動(dòng)，這兩種方式均能改善糖尿病患者及糖尿病前期人群異常血糖代謝。但由于遺傳差異，運(yùn)動(dòng)干預(yù)效果有所不同。在糖尿病前期人群中，約1/5個(gè)體不能從運(yùn)動(dòng)中獲益[1]。檢測(cè)運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)糖尿病前期人群糖脂代謝的敏感性，可為制定糖尿病前期人群運(yùn)動(dòng)干預(yù)個(gè)體化處方提供依據(jù)。

電壓門控鉀通道Q亞家族成員1(voltage-gated potassium channel subfamily member 1,KCNQ1)基因是Yasuda等[2]通過全基因組關(guān)聯(lián)分析法，在亞洲人群中確定的T2DM易感基因。該基因在不同種群中分布有很大差異，其編碼的電壓門控鉀通道蛋白在血管平滑肌、胰腺組織高表達(dá)，參與糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生，并可能參與糖尿病的原發(fā)病變[3]。KCNQ1基因基因區(qū)的多個(gè)多態(tài)位點(diǎn)與糖尿病發(fā)生有關(guān)[4-6]。

本研究從KCNQ1基因區(qū)選擇標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)位點(diǎn)，觀察SNP基因型和單體型與糖尿病前期人群有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)敏感性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

從2015年1月30日起，在國(guó)營(yíng)長(zhǎng)風(fēng)機(jī)器廠社區(qū)活動(dòng)中心招募受試者，并經(jīng)過初篩和復(fù)篩。初篩時(shí)測(cè)空腹血糖并進(jìn)行口服糖耐量試驗(yàn)，篩選出符合美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)制定糖尿病前期糖調(diào)節(jié)受損(impaired glucose regulation,IGR)標(biāo)準(zhǔn)的人群，包括空腹血糖受損(impaired fasting glucose,IFG)、葡萄糖耐量受損(impaired glucose tolerance,IGT)或IFG/IGT人群，對(duì)未進(jìn)行藥物治療并自愿參加運(yùn)動(dòng)干預(yù)者進(jìn)行復(fù)查。兩次篩查均符合IGR診斷標(biāo)準(zhǔn)的受試者，完成健康體檢，經(jīng)專科醫(yī)生診斷無運(yùn)動(dòng)測(cè)試禁忌癥者，建立健康檔案并簽署知情同意書，進(jìn)行觀察。最終納入受試者70例。在試驗(yàn)過程中，4例因個(gè)人身體原因退出，最終完成測(cè)試者66例。

本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過。

1.2 研究方法

1.2.1 指標(biāo)測(cè)定

在運(yùn)動(dòng)干預(yù)前后，同一條件下分別對(duì)受試者進(jìn)行糖脂代謝指標(biāo)測(cè)試。主要包括空腹血糖(fasting plasma glucose,FPG)、口服75 g葡萄糖后2 h血糖 (2 hours postprandial blood glucose,P2hBG)、空腹胰島素(fasting insulin,FINS)、糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin,GHb)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)。

1.2.2 運(yùn)動(dòng)處方

采用功率自行車遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)法測(cè)定受試者心臟功能能力(functional capacity,F.C.)，作為制定運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的依據(jù)。運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度設(shè)定：1～4周40%～50%F.C.，5～12周50%～65%F.C.。運(yùn)動(dòng)方式為健步走，每次40～50 min，每周3～5次，持續(xù)3個(gè)月。

在運(yùn)動(dòng)干預(yù)過程中，通過舉辦專家講座、發(fā)放學(xué)習(xí)資料等方式，強(qiáng)化受試者運(yùn)動(dòng)干預(yù)相關(guān)知識(shí)。通過短信、電話、現(xiàn)場(chǎng)跟蹤等方式，指導(dǎo)受試者用心率表、計(jì)步器，結(jié)合脈搏、主觀體力感覺等控制運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度和運(yùn)動(dòng)量。

1.2.3 基因多態(tài)性分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析研究所得數(shù)據(jù)。計(jì)量資料采用（±s）表示，計(jì)數(shù)資料采用（%）表示，分別以t檢驗(yàn)與χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

選取KCNQ1基因區(qū)的7個(gè)標(biāo)簽SNP位點(diǎn)rs2299620、 rs231362、 rs2237892、 rs2237895、rs2237897、rs151290、rs2283228。所選位點(diǎn)在基因組中的基本情況見表1。

從靜脈血白細(xì)胞提取基因組DNA。采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)對(duì)篩選的SNP進(jìn)行分型。PCR引物和單堿基延伸引物用Assay Designer(Sequenom)軟件設(shè)計(jì)，由MassARRAYTyper軟件系統(tǒng)完成SNP位點(diǎn)基因型分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用χ2檢驗(yàn)分析各位點(diǎn)基因型分布是否符合哈溫平衡。單個(gè)位點(diǎn)不同基因型之間干預(yù)敏感性的差異以指標(biāo)干預(yù)前初始值作為協(xié)變量進(jìn)行協(xié)方差分析，顯著性水平α=0.05。

Shesis在線軟件(http://analysis.bio-x.cn/myanalysis.php)計(jì)算同一基因不同位點(diǎn)間的D'和r2，以測(cè)量對(duì)應(yīng)位點(diǎn)間的連鎖不平衡(linkage disequilibrium,LD)緊密程度，并計(jì)算單體型頻率。多個(gè)位點(diǎn)的單體型分析采用R-平臺(tái)下haplo.stats的haplo.score軟件。以指標(biāo)干預(yù)前初始值為協(xié)變量，以干預(yù)前后差值(Δ)表示各指標(biāo)的干預(yù)敏感性，分析不同單體型的干預(yù)敏感性差異。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

各位點(diǎn)基因型分布均符合哈溫平衡(P＞0.05)。rs2237892、rs2237897位點(diǎn)中TT基因型僅2例，屬極低基因型頻率，根據(jù)相近合并的原則，將其與CT基因型合并統(tǒng)計(jì)。

2.1 單個(gè)位點(diǎn)多態(tài)性與糖脂代謝的關(guān)系

rs2299620位點(diǎn)TT基因型P2hBG最低(P＜0.05)。見表2。其余位點(diǎn)不同基因型在有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)前后指標(biāo)無顯著性差異(數(shù)據(jù)略)。

表1 所選位點(diǎn)基本情況

表2 rs2299620位點(diǎn)不同基因型運(yùn)動(dòng)干預(yù)前后指標(biāo)比較

2.2 單體型與糖脂代謝的關(guān)系

7個(gè)多態(tài)位點(diǎn)D'和r2見表3。對(duì)D'＞0.33且r2＞0.1的位點(diǎn)，組合成可能的單體型，計(jì)算單體型頻率，頻率＜0.03的單體型被忽略，進(jìn)行單體型分析。結(jié)果顯示，rs2237897-rs2299620位點(diǎn)的單體型中，T-C單體型攜帶者ΔFINS高于非T-C單體型攜帶者；C-T單體型攜帶者ΔP2hBG高于非C-T單體型攜帶者。由rs2283228-rs2237892位點(diǎn)組成的單體型中，A-C單體型攜帶者ΔLDL高于非A-C單體型攜帶者。由rs2299620-rs151290位點(diǎn)組成的單體型中，T-C單體型攜帶者ΔP2hBG高于非T-A單體型攜帶者；rs2299620-rs2237892位點(diǎn)組成的單體型中，T-T單體型攜帶者ΔP2hBG高于非T-T單體型攜帶者。見表4。其余不同位點(diǎn)組成的單體型在運(yùn)動(dòng)干預(yù)前后糖脂代謝指標(biāo)均無顯著性差異(數(shù)據(jù)略)。

3 討論

表3 KCNQ1基因7個(gè)多態(tài)位點(diǎn)兩兩間D'/r2

表4 KCNQ1基因部分位點(diǎn)單體型干預(yù)前后糖脂代謝指標(biāo)差值比較

Hu等[7]在包括1769例T2DM和1734例血糖正常者的中國(guó)漢族人群中進(jìn)行研究，在KCNQ1基因中發(fā)現(xiàn) 4個(gè) SNP 位點(diǎn) rs2074196、rs2237892、rs2237895、rs2237897與糖尿病發(fā)病相關(guān)。陳建豐等[8]、劉英等[9]的研究也證實(shí)rs2237892位點(diǎn)與T2DM發(fā)病相關(guān)。

日本Unoki等[10]對(duì)207,097例日本人的SNP進(jìn)行篩查，證實(shí)KCNQ1是T2DM的重要侯選基因，且rs2283228、rs2237895、rs2237897是其中3個(gè)與T2DM發(fā)病密切相關(guān)的位點(diǎn)。KCNQ1基因多態(tài)性與T2DM發(fā)病的相關(guān)性也在其他人群中得到驗(yàn)證[5-6,11-12]。

對(duì)特定人群使用相同運(yùn)動(dòng)處方干預(yù)時(shí)，效果存在明顯個(gè)體差異。如白細(xì)胞介素-6基因G174C多態(tài)與訓(xùn)練對(duì)空腹血糖和葡萄糖耐量的影響相關(guān)[13]；維生素D受體基因BsmI多態(tài)與低體力活動(dòng)對(duì)空腹血糖的影響水平之間存在關(guān)聯(lián)[14]。推測(cè)是由于不同基因多態(tài)對(duì)糖調(diào)節(jié)影響所致。Lakka等[15]的研究顯示，瘦素基因A19G和瘦素受體基因K109R多態(tài)決定了運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)葡萄糖動(dòng)態(tài)平衡的個(gè)體差異；過氧化物酶增殖體活化受體-γ基因Pro12Ala多態(tài)對(duì)高加索人、日本人運(yùn)動(dòng)干預(yù)敏感性均存在相關(guān)性[16-17]；Sakane等[18]對(duì)61例T2DM患者運(yùn)動(dòng)干預(yù)12周后發(fā)現(xiàn)，腎上腺素受體Ⅲ基因Trp64Arg多態(tài)與患者胰島素抵抗的運(yùn)動(dòng)干預(yù)敏感性相關(guān)。國(guó)內(nèi)研究基因多態(tài)性與糖尿病發(fā)生及其并發(fā)癥發(fā)展之間關(guān)系較多[19-20]，而少見其與運(yùn)動(dòng)干預(yù)敏感性之間關(guān)系的研究。

本研究選取的7個(gè)位點(diǎn)均為標(biāo)簽SNP，具有較好的代表性。經(jīng)HaploView軟件分析，rs231362、rs2237892、rs2237895、rs2237897、rs2283228等5個(gè)多態(tài)位點(diǎn)有中度連鎖不平衡。一項(xiàng)以亞洲人群為研究對(duì)象的系統(tǒng)綜述，包括30個(gè)公開發(fā)表的病例對(duì)照實(shí)驗(yàn)，114,140例患者和167,322例對(duì)照，表明這5個(gè)多態(tài)位點(diǎn)是糖尿病發(fā)生的危險(xiǎn)因子[4]。另有多項(xiàng)研究證實(shí)，rs2237892與糖尿病的發(fā)生相關(guān)[21-23]。本研究顯示，rs2299620位點(diǎn)TT基因型，P2hBG運(yùn)動(dòng)后下降。與非單體型攜帶者相比，rs2237897-rs2299620的T-C單體型與ΔFINS相關(guān)聯(lián)，rs2237897-rs2299620位點(diǎn)的C-T單體型、rs2299620-rs2237892位點(diǎn)的T-T單體型、rs2299620-rs151290位點(diǎn)組成的T-A單體型均與ΔP2hBG相關(guān)聯(lián)，rs2283228-rs2237892位點(diǎn)的A-C單體型與ΔLDL相關(guān)聯(lián)。

運(yùn)動(dòng)改變胰島素敏感性，是運(yùn)動(dòng)改善糖脂代謝的主要途徑。在鉀離子通道蛋白的調(diào)節(jié)下，胰島β細(xì)胞KCNQ1蛋白表達(dá)增多，從而減少胰島素分泌，使血糖水平改變[24]，這可能是鉀離子通道蛋白參與糖尿病的部分機(jī)制。KCNQ1基因多態(tài)影響運(yùn)動(dòng)干預(yù)胰島素敏感性的具體機(jī)制尚不清楚，可能通過影響信號(hào)通路蛋白結(jié)合活性，進(jìn)而影響目的基因的表達(dá)[25]。本研究揭示的相關(guān)基因多態(tài)位點(diǎn)的生物學(xué)活性還有待進(jìn)一步深入研究，為有效防治糖尿病的發(fā)生發(fā)展提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Van de Weijer T,Sparks LM,Phielix E,et al.Relationships between mitochondrial function and metabolic flexibility in type 2 diabetes mellitus[J].PLoS One,2013,8(2):e51648.

[2]Yasuda K,Miyake K,Horikawa Y,et al.Variants in KCNQ1 are associated with susceptibility to type 2 diabetes mellitus[J].Nat Genet,2008,40(9):1092-1097.

[3]吳志,陳美娟.鈣鉀離子通道與糖尿病心血管疾病相關(guān)性研究[J].臨床藥物治療雜志,2011,9(1):38-41.

[4]Liu J,Wang F,Wu Y,et al.Meta-analysis of the effect of KCNQ1 gene polymorphism on the risk of type 2 diabetes[J].Mol Biol Rep,2013,40(5):3557-3567.

[5]Rees SD,Hydrie MZ,Shera AS,et al.Replication of 13 genome-wide association(GWA)-validated risk variants for type 2 diabetes in Pakistani populations[J].Diabetologia,2011,54(6):1368-1374.

[6]Saif-Ali R,Ismail IS,Al-Hamodi Z,et al.KCNQ1 haplotypes associate with type 2 diabetes in Malaysian Chinese Subjects[J].Int J Mol Sci,2011,12(9):5705-5718.

[7]Hu C,Wang C,Zhang R,et al.Variations in KCNQ1 are associated with type 2 diabetes and beta cell function in a Chinese population[J].Diabetologia,2009,52(7):1322-1325.

[8]陳建豐,潘天榮.KCNQ1基因rs2237892多態(tài)性與合肥地區(qū)漢族人2型糖尿病的相關(guān)性[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2018,53(1):110-113.

[9]劉英,周英,楊海燕,等.寧夏回漢族KCNQ1基因多態(tài)性與2型糖尿病的相關(guān)性研究[J].安徽醫(yī)藥,2015,19(7):1278-1281.

[10]Unoki H,Takahashi A,Kawaguchi T,et al.SNPs in KCNQ1 are associated with susceptibility to type 2 diabetes in East Asian and European populations[J].Nat Genet,2008,40(9):1098-1102.

[11]Tan J,Nurbays S,Gardner D,et al.Genetic variation in KCNQ1 associates with fasting glucose and beta-cell function:astudy of 3,734 subjects comprising three ethnicities living in Singapore[J].Diabetes,2009,58(6):1445-1449.

[12]Fatima SS,Chaudhry B,Khan TA,et al.KCNQ1 rs2237895 polymorphism is associated with gestational diabetes in Pakistani women[J].Pak J Med Sci,2016,32(6):1380-1385.

[13]McKenzie JA,Weiss EP,Ghiu IA,et al.Influence of the interleukin-6-174 G/C gene polymorphism on exercise training-induced changes in glucose tolerance indexes[J].J Appl Physiol,2004,97(4):1338-1342.

[14]Ortlepp JR,Lauscher J,Hoffmann R,et al.The vitamin D receptor gene variant is associated with the prevalence of type 2 diabetes mellitus and coronary artery disease[J].Diabet Med,2001,18(10):842-845.

[15]Lakka TA,Rankinen T,Weisnagel SJ,et al.Leptin and leptin receptor gene polymorphisms and changes in glucose homeostasis in response to regular exercise in nondiabetic individuals:the HERITAGE family study[J].Diabetes,2004,53(6):1603-1608.

[16]Franks PW,Mesa JL,Harding AH,et al.Gene-lifestyle interaction on risk of type 2 diabetes[J].Nutr Metab Cardiovasc Dis,2007,17(2):104-124.

[17]Kahara T,Takamura T,Hayakawa T,et al.PPARgamma gene polymorphism is associated with exercise-mediated changes of insulin resistance in healthy men[J].Metabolism,2003,52(2):209-212.

[18]Sakane N,Yoshida T,Yoshioka K,et al.Trp64Arg mutation of beta3-adrenoceptor gene is associated with diabetic nephropathy in Type II diabetes mellitus[J].Diabetologia,1998,41(12):1533-1534.

[19]Al-Shammari MS,Al-Ali R,Al-Balawi N,et al.Type 2 diabetes associated variants of KCNQ1 strongly confer the risk of cardiovascular disease among the Saudi Arabian population[J].Genet Mol Biol,2017,40(3):586-590.

[20]Huang KC,Li TM,Liu X,et al.KCNQ1 variants associate with hypertension in type 2 diabetes and affect smooth muscle contractility in vitro[J].J Cell Physiol,2017,232(12):3309-3316.

[21]Cui LJ,Chang XY,Zhu LY,et al.Relationship between the polymorphisms in KCNQ1 and type 2 diabetes in Chinese Kazakh population[J].Genet Mol Res,2016,15(2):1-10.

[22]Zhang W,Wang H,Guan X,et al.Variant rs2237892 of KCNQ1 is potentially associated with hypertension and macrovascular complications in type 2 diabetes mellitus in a Chinese Han population[J].Genomics Proteomics Bioinformatics,2015,13(6):364-370.

[23]Ao D,Wang HJ,Wang LF,et al.The rs2237892 polymorphism in KCNQ1 influences gestational diabetes mellitus and glucose levels:a case-control study and meta-analysis[J].PLoS One,2015,10(6):1-11.

[24]Yamagata K,Senokuchi T,Lu M,et al.Voltage-gated K+channel KCNQ1 regulates insulin secretion in MIN6 beta-cell line[J].Biochem Biophys Res Commun,2011,407(3):620-625.

[25]Hiramoto M,Udagawa H,Ishibashi N,et al.A type 2 diabetes-associated SNP in KCNQ1(rs163184)modulates the binding activity of the locus for Sp3 and Lsd1/Kdm1a,potentially affecting CDKN1C expression[J].Int J Mol Med,2018,41(2):717-728.