劉雪云，徐守宇

1.浙江中醫(yī)藥大學附屬第三醫(yī)院，浙江杭州市310000；2.浙江中醫(yī)藥大學，浙江杭州市310053

骨骼肌穩(wěn)態(tài)取決于蛋白質周轉的動態(tài)平衡。老年人及許多疾病患者很難承受高強度耐力訓練，即＞70%單次最大負荷量(one repetition maximum,1RM)，每周3次并維持5～12周[1-2]。既往研究表明[3-7]，阻血結合低強度抗阻訓練(20%～30%1RM)，在增加肌肉體積和力量方面，可產生與高強度抗阻訓練相似的效果，且安全有效。前期我們開發(fā)了阻血誘導骨骼肌肥大大鼠模型[8]，基因芯片研究發(fā)現(xiàn)，阻血后超過2倍變化的基因共1649個，其中信號轉導接頭蛋白-2(signal-transducing adaptor protein-2,STAP2)和輸入蛋白5(importin 5,Ipo5)有顯著變化[9]。

myostatin是轉化生長因子(transforming growth factor-β,TGF-β)超家族成員之一，是肌肉生長的負調節(jié)因子[10]，在維持肌肉蛋白質的動態(tài)平衡中有重要作用。本研究通過shRNA慢病毒感染靶基因STAP2和Ipo5，檢測不同狀態(tài)下STAP2、Ipo5和myostatin表達，探討STAP2和Ipo5對骨骼肌蛋白質周轉的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康雄性清潔級Sprague-Dawley大鼠12只，初始體質量(310±10)g，鼠齡32周，由浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供并飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件：溫度24～26℃，濕度55%～65%，24 h循環(huán)光照，普通飼料喂養(yǎng)，自由攝食和飲水。采用隨機數(shù)字法分為模型組和對照組，每組6只。

實驗過程中對大鼠的處置嚴格遵守動物倫理準則和指南的相關規(guī)定。

1.2 實驗試劑與儀器

myostatin抗體、GAPDH抗體：美國PROTEINTECH公司。Ipo5抗體、STAP2抗體：北京博奧森公司。第二抗體：Jackson分裝?；騃po5、STAP2過表達質粒，Lipofectamine 2000轉染試劑盒：美國INVITROGEN公司。ECL試劑盒、PVDF膜(0.45 μm)：德國MILLIPORE公司。GL-400SD超聲波細胞破碎儀：南京先歐儀器制造有限公司。5810R型臺式高速冷凍離心機：北京離心機廠。SDS-PAGE蛋白凝膠電泳儀、垂直電泳轉移儀：美國BIO-RAD公司。BTY型脫色搖床：江蘇太倉醫(yī)用儀器廠。FluorChem HD2凝膠成像分析系統(tǒng)：美國PROTEINSIMPLE公司。微量移液器：德國EPPENDORF公司。

1.3 模型制備

參照前期研究[8]制備阻血誘導大鼠骨骼肌肥大模型。模型組右后肢在膝上方近關節(jié)處用橡皮筋捆扎，每次30 min，每周2次，共2周。捆扎時在MoorFCPI散斑全幀實時掃描成像系統(tǒng)下觀察外周循環(huán)血流，判斷是否阻血成功。最后一次捆扎24 h后，所有大鼠腹膜注射戊巴比妥鈉1.5 ml/kg麻醉，分離比目魚肌，稱重，立即異戊烷和液氮冷凍，進行細胞體外培養(yǎng)。

1.4 細胞培養(yǎng)

將比目魚肌用胰蛋白酶處理成單個細胞，制成細胞懸液，轉入培養(yǎng)液中，入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用shRNA慢病毒及過表達質粒轉染模型組細胞，實現(xiàn)候選基因STAP2和Ipo5的敲落、過表達和功能挽救。對照組正常培養(yǎng)。

1.4.1 基因沉默

轉染前24 h將待轉染的細胞置12孔板。加入完全培養(yǎng)基(含有血清和抗生素)1 ml孵育過夜。轉染當天細胞應達到約50%平鋪。準備完全培養(yǎng)基和Polybrene?混合物，Polybrene終濃度為5μg/ml。移去培養(yǎng)基并每孔添加Polybrene/培養(yǎng)基混合物于1 ml。在室溫下溶化慢病毒顆粒，輕輕混勻，加入培養(yǎng)液中；輕輕振動培養(yǎng)板使其混勻并孵育過夜。移去混合培養(yǎng)液，添加完全培養(yǎng)基(不含Polybrene)1 ml，孵育細胞過夜。選擇穩(wěn)定表達shRNA的克隆，根據細胞類型不同將其分成1∶3到1∶5，繼續(xù)在完全培養(yǎng)基中孵育24～48 h。以后每天用Puromycindihydrochloriede篩選穩(wěn)定表達shRNA的克隆。

1.4.2 基因過表達

轉染前1 d，將1.5×105細胞接種于12孔板，加不含抗生素的完全培養(yǎng)基500 μl，保證轉染時細胞匯合達90%～95%。將總RNA 0.8 μg稀釋于無血清無抗生素培養(yǎng)液50 μl中輕輕混勻。將Lipofectamine 2000 2 μl稀釋于無血清無抗生素培養(yǎng)液50 μl中，輕輕混勻，室溫孵育5 min。將以上兩種液體混合，輕輕混勻，室溫孵育20 min。吸去培養(yǎng)板的培養(yǎng)基，用PBS清洗細胞2次。將復合物(總體積100 μl)加入培養(yǎng)孔，前后搖動培養(yǎng)板使其分布均勻。置培養(yǎng)箱孵育4～6 h，更換含血清培養(yǎng)液，去除復合物。48 h后觀察轉入基因表達情況。

1.4.3 基因挽救

細胞基因沉默24 h后，在候選基因過表達質粒轉染(操作同前)，實現(xiàn)基因挽救。

1.5 Western blotting

收集各組比目魚肌細胞，PBS洗2遍，RIPA裂解液裂解30 min，4℃、12000 r/min離心10 min。收集上清液，加DEPC處理的去離子水20 ml溶解，-80℃保存。

提取的蛋白質6%和10%SDS-PAGE電泳，電轉至甲醇浸透的PVDF膜上，TBST(含150 mmol/L Na-CI、10 mmol/L Tris-HCI、0.5%Tween 20，pH=7.5)洗滌 10 min，共 3 遍 ，加 Ipo5(1∶200)、STAP2(1∶200)、myostatin(1∶1000)、GAPDH(1∶2000)一抗，4℃冰箱過夜。TBST洗膜10 min，共3遍；滴加生物素化二抗(1∶10000)，TBST洗膜10 min，共3遍；滴加ECL發(fā)光液孵育5 min，顯影，凝膠成像儀照相記錄。Image-Pro Plus掃描條帶，計算相對灰度。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0進行統(tǒng)計學處理。STAP2、Ipo5及myostatin相對表達量均以(±s)表示，對照組和模型組兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；模型組、沉默組、過表達組和挽救組多組間比較采用單因素方差分析，事后兩兩比較采用LSD-t檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結果

模型組較對照組STAP2表達顯著升高，Ipo5和myostatin表達顯著下降(P＜0.001)。見表1、表2。

shRNA慢病毒轉染各組中，與模型組比較，沉默組STAP2表達下降，myostatin表達上升(P＜0.05)，過表達組STAP2升高，myostatin表達下降(P＜0.05)，挽救組STAP2和myostatin表達介于沉默和過表達之間，見表3、圖1。與模型組比較，沉默組Ipo5和myostatin表達下降(P＜0.05)，過表達組Ipo5和myostatin表達上升(P＜0.05)，挽救組Ipo5和myostatin表達介于沉默和過表達之間。見表4、圖2。對照組、模型組、沉默組、過表達組、挽救組基因myostatin表達隨STAP2降低而升高，隨Ipo5升高而升高。

表1 兩組STAP2和myostain蛋白表達

表2 兩組Ipo5和myostain蛋白表達

表3 各轉染組STAP2和myostain蛋白表達

表4 各轉染組Ipo5和myostain蛋白表達

圖2 各組Ipo5和myostain蛋白表達

3 討論

流行病學研究表明，90%以上與抗阻訓練相關的損傷是由于肌肉超負荷引起[11]。阻血可有效防止高強度抗阻訓練帶來的肌肉損傷[12-13]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)和磷脂酰肌醇 3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/Akt/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)兩個信號通路是控制蛋白質合成的主要途徑[14-16]。阻血結合低強度抗阻訓練可顯著激活上述兩條信號通路[17-19]。運動刺激還激活Wnt信號通路，進而恢復因年齡或肌源性疾病引起的肌肉損傷[20]。

本研究顯示，STAP2的表達水平和myostatin相反，提示STAP2表達上調可促進蛋白質合成。GTPase活化酶可以激活MAPK三種不同的信號通路[21]。GTPase酶屬于Rho家族，包括Rho、Rac和Cdc42，在肌動蛋白細胞骨架的動態(tài)組織中發(fā)揮中心作用[22]。已有研究發(fā)現(xiàn)，STAP2可以直接激活Rac和Cdc42[23]，也可以通過Src同源2域，間接銜接黏著斑激酶到Grb2銜接蛋白，間接激活MAPK信號傳導通路[24]。

含IQ基元GTP酶激活蛋白1(IQ motif containing GTPase activating protein 1,IQGAP1)可調節(jié)Cdc42和Rac的活性[25]，可與肌動蛋白結合，參與細胞骨架的重組、細胞黏附及細胞周期等多種細胞過程；而Ipo5可通過Wnt信號通路調節(jié)IQGAP1蛋白的轉錄[26]。我們推測，Ipo5可能通過Wnt和MAPK信號通路，調節(jié)蛋白質周轉，進而影響骨骼肌肥大。

有臨床研究表明，阻血訓練24 h后，肌肉蛋白質合成明顯增加，而蛋白質降解未受明顯抑制[17]。Booth[27]研究顯示，蛋白質合成減少可能在肌肉萎縮的始動發(fā)生中起重要作用[28]。我們推測，阻血對骨骼肌肥大的急性效應和慢性效應機制可能并不相同。但本研究未觀察阻血與基因表達的關聯(lián)，有待進一步研究。

綜上所述，阻血下，STAP2和Ipo5可通過不同信號通路調節(jié)蛋白質周轉，進而維持骨骼肌動態(tài)平衡。未來需進一步明確基因表達隨阻血時間不同的變化曲線，從而最大程度促進骨骼肌肥大。

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