程斌，宋煥瑾，李鋒濤，林磊，薛建利，吳昊，葉勁濤

1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院骨科，陜西西安市710004；2.漢中市中心醫(yī)院骨科，陜西漢中市723000

在早期研究中，人們認(rèn)為缺血是組織損傷、壞死的主要原因，但隨著研究深入，發(fā)現(xiàn)在缺血一段時間后，如果組織供血恢復(fù)，該組織的損傷程度與單純?nèi)毖啾雀鼮閲?yán)重，此即組織的缺血再灌注損傷。多種原因可以導(dǎo)致脊髓缺血再灌注損傷，如脊柱創(chuàng)傷、血管外科手術(shù)等。

大多數(shù)研究認(rèn)為，神經(jīng)組織缺血再灌注損傷沒有有效治療方法，目前主要使用大劑量糖皮質(zhì)激素和神經(jīng)營養(yǎng)藥物等治療[1]。對脊髓缺血再灌注損傷機(jī)制的研究集中在炎癥損傷、氧化應(yīng)激、自由基損傷、興奮性中毒、能量物質(zhì)缺乏及細(xì)胞凋亡等方面，目前認(rèn)為細(xì)胞凋亡是造成損傷的主要機(jī)制[2]。

凋亡是重要的生理過程，在促凋亡機(jī)制及抗凋亡機(jī)制之間存在精確的平衡。凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)作為抗凋亡蛋白家族成員，可以抑制caspase凋亡信號途徑，在許多物種的凋亡調(diào)控中起重要作用[3]。人類的8種凋亡抑制蛋白已被廣泛研究，其中survivin可以抑制procaspase-3/procaspase-7或caspase-3/caspase-7的活性，抑制凋亡[4]。

人參皂甙Rb1屬于人參二醇，具有抗氧化、抗疲勞、抗衰老、抗腫瘤等作用[5]。本研究探索survivin蛋白和脊髓缺血再灌注損傷之間的關(guān)系，以及不同劑量人參皂甙Rb1治療脊髓缺血再灌注損傷的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

清潔級成年健康Sprague-Dawley大鼠，體質(zhì)量(213±15)g，購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。

將實(shí)驗(yàn)動物分為假手術(shù)組、模型組和藥物D10、D20、D40、D80組，藥物各組劑量分別為10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg、80 mg/kg，每組12只。

1.2 主要儀器及試劑

TUNEL試劑盒：南京建成生物工程研究所。survivin單克隆抗體：美國SANTA CRUZ公司。SP免疫組化試劑盒、DAB試劑：北京博奧森生物技術(shù)有限公司。多聚甲醛：天津化學(xué)試劑廠。人參皂甙Rb1粉劑：中國藥品生物制品檢定所。HE染液：溫州康泰生物科技有限公司。苯巴比妥鈉粉劑：美國SIGMA公司。

1.3 造模方法

動物術(shù)前禁食一夜，自由飲水。3%苯巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，保持自主呼吸。動物置于恒溫毯上，肛溫探頭置入肛門，保持大鼠體溫37.1～37.5℃。頸正中切口，顯露左頸總動脈，置入PE50導(dǎo)管并連接于放血裝置及監(jiān)護(hù)儀，監(jiān)測近端動脈壓及心率；在大鼠尾中段上1/3顯露尾動脈，置入PE50導(dǎo)管并連接監(jiān)護(hù)儀，監(jiān)測遠(yuǎn)端動脈壓。左腹股溝切口，顯露左股動脈，遠(yuǎn)端結(jié)扎后輕微牽拉，近端剪一切口，將Fogarty導(dǎo)管經(jīng)股動脈置入至胸主動脈高度，立即給予200 U肝素鈉，用注射器推入生理鹽水0.05 ml，避免球囊松弛。立即打開放血裝置放血，在1 min內(nèi)將近端平均動脈壓降至45 mmHg，記錄血壓及放血量。10 min后，松開球囊，立即勻速回輸放血裝置內(nèi)的血液，回輸時間控制在1 min左右。

術(shù)后監(jiān)測血壓l0 min后取出動脈插管，結(jié)扎動脈，皮下注射硫酸魚精蛋白4 mg。動物置25～30℃保溫箱內(nèi)，等待動物蘇醒后放回飼養(yǎng)籠中。

藥物組大鼠于脊髓缺血前30 min腹腔注射相應(yīng)劑量人參皂甙Rb1，術(shù)后每天腹腔注射相同劑量人參皂甙Rb1。

實(shí)驗(yàn)中意外死亡大鼠，隨機(jī)另取大鼠補(bǔ)充。

1.4 BBB評分

造模后48 h，各組大鼠行BBB評分。評分人員為未參加本組實(shí)驗(yàn)而熟悉評分標(biāo)準(zhǔn)的人員。

1.5 標(biāo)本采集

BBB評分后，心臟采血3 ml，室溫放置2 h后，1000 r/min離心10 min，取血清，置于-20℃冰箱保存。心臟采血后，予3%苯巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，升主動脈插管，剪開右心房，快速灌注生理鹽水250 ml后，繼續(xù)灌注4%多聚甲醛至右心房流出清亮多聚甲醛、尸體僵硬。立即取出腰段脊髓1 cm，4℃ 4%多聚甲醛后固定24 h，自來水浸洗24 h，石蠟包埋，于L3節(jié)段2 mm范圍內(nèi)連續(xù)切片，厚10 μm。

1.6 HE染色

取各組脊髓組織石蠟切片行HE染色。

1.7 免疫組織化學(xué)染色

各組脊髓組織石蠟切片脫蠟，梯度乙醇和蒸餾水復(fù)水，3%H2O2孵育30 min，滴加5%BSA封閉液，室溫20 min，滴加survivin一抗(1∶100)，濕盒內(nèi)4℃過夜。滴加生物素化二抗工作液，室溫20 min；滴加SABC，室溫15 min。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化。采用高清晰彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)，每張切片取5個不同視野拍片，進(jìn)行圖像分析，計數(shù)脊髓前角survivin陽性神經(jīng)元。

1.8 TUNEL檢測

石蠟切片脫蠟及復(fù)水同前，使用PBS液處理。采用高清晰彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)，每張切片隨機(jī)取5個不同視野拍片，進(jìn)行圖像分析，計數(shù)脊髓前角TUNEL陽性神經(jīng)元。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 BBB評分

模型組BBB評分較假手術(shù)組下降(P＜0.05)。各藥物組BBB評分雖較假手術(shù)組降低(P＜0.05)，但比模型組高(P＜0.05)。隨著藥物劑量的增大，評分也相應(yīng)增高，但D40組與D80組相差不大。見表1。

2.2 HE染色

假手術(shù)組脊髓神經(jīng)元胞漿內(nèi)尼氏體清晰可見；模型組神經(jīng)元皺縮，尼氏體模糊且數(shù)量減少，脊髓組織出現(xiàn)大小不一的空泡變性；各藥物組均可見損傷性改變，但損傷程度較模型組輕。見圖1。

2.3 免疫組化及TUNEL染色

模型組脊髓前角survivin蛋白陽性細(xì)胞較假手術(shù)組增多(P＜0.05)，TUNEL陽性細(xì)胞增多(P＜0.05)。各藥物組survivin蛋白陽性細(xì)胞較模型組增多(P＜0.05)，TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)減少(P＜0.05)。隨著藥物干預(yù)劑量增大，survivin蛋白陽性細(xì)胞數(shù)增多，TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)減少，但D40組與D80組相差不大。見表1、圖2、圖3。

survivin蛋白陽性細(xì)胞數(shù)與TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.601,P＜0.05)。

圖1 各組脊髓HE染色(400×)

圖2 各組脊髓survivin免疫組化染色(400×)

表1 各組BBB評分、脊髓survivin陽性細(xì)胞計數(shù)、脊髓TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)比較

3 討論

本研究顯示，大鼠脊髓缺血再灌注損傷可使脊髓前角survivin陽性細(xì)胞數(shù)增多；予人參皂甙Rb1干預(yù)后，survivin陽性細(xì)胞數(shù)繼續(xù)增多，并隨藥物劑量增大而增加，但大于40 mg/kg后，這種趨勢不再明顯。這種變化與大鼠脊髓前角神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)呈負(fù)相關(guān)。

survivin由142個氨基酸構(gòu)成，其N-端桿狀病毒IAP重復(fù)結(jié)構(gòu)(baculorius-IAP repeat,BIR)域可抑制procaspase-3/procaspase-7或caspase-3/caspase-7的活性，抑制凋亡；C-端沒有其他IAP家族成員所具有的環(huán)指狀結(jié)構(gòu)。survivin單體通過BIR域相互聚集，結(jié)合成對稱二聚體，這種結(jié)構(gòu)為survivin抗凋亡所必需。survivin的分布具有細(xì)胞選擇性，在胚胎及胎兒組織器官中高度表達(dá)。但成人除了胸腺、腎臟、胎盤、睪丸等終末分化組織外，并無表達(dá)。目前多數(shù)研究著眼于肝癌、肺癌及淋巴瘤等腫瘤方面的研究[4]，僅有少量研究提示，survivin可在腦細(xì)胞缺血再灌注損傷后表達(dá)升高[6]。survivin可以與X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)結(jié)合，形成survivin-XIAP復(fù)合物，促進(jìn)XIAP穩(wěn)定性并協(xié)同抑制caspase-9，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。也有文獻(xiàn)指出[7]，survivin不能通過與XIAP結(jié)合抑制凋亡。survivin可以在凋亡過程中，特異性調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)膜蛋白Smac/Diablo的釋放，還通過與Smac/Diablo結(jié)合，延遲其釋放[8]?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，脊髓缺血再灌注損傷后，細(xì)胞凋亡主要發(fā)生在前角，但具體機(jī)制尚不清楚[9]。

人參皂甙是人參的主要活性成分。人參的根莖中含有2%～3%人參皂甙，主要是Rg1、Rc、Rd、Re、Rb1、Rb2及Rb0。西洋參人參皂甙含量最高。人參皂甙有與糖基鏈接4環(huán)甾類結(jié)構(gòu)，迄今已從西洋參根莖種發(fā)現(xiàn)并分離出超過40種人參皂甙。每種人參皂甙至少含有2個(C-3及C-20)或3個(C-3、C-6及C-20)羥基基團(tuán)，羥基集團(tuán)可以不與糖基相連，也可以單體、二聚體或三聚體形式與糖基相連。由于C-20位羥基基團(tuán)的位置存在變化，所以人參皂甙同樣具有立體異構(gòu)體。根據(jù)人參皂甙的分子結(jié)構(gòu)，可以將其分為人參二醇(protopanaxadiol,PD)及人參三醇(protopanaxatriol,PT)兩類。PD包括Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rg3、Rh2及Rh3，其糖基與3-位達(dá)瑪烷型三萜相連。PT包括Re、Rf、Rg1、Rg2及Rh1，其糖基與6-位達(dá)瑪烷型三萜相連[10]。偽人參皂甙F11屬于PT，其碳鏈20位C被四氫呋喃環(huán)所取代。25-OH-PPD及25-OH-PPT等新發(fā)現(xiàn)的人參皂甙從人參的果實(shí)中分離出來，具有明顯抗癌作用[11]。人參皂甙Rb1、Rb2、Rc及Rd的4種丙二?；苌镆脖话l(fā)現(xiàn)。Ro及這些丙二酰基衍生物也被稱為酸性人參皂甙，而其他人參皂甙被稱為中性人參皂甙。

人參皂甙Rb1屬PD，具有抗氧化、抗疲勞、抗衰老作用，可以有效阻斷超氧陰離子生成，并下調(diào)內(nèi)皮型一氧化氮合酶。人參皂甙Rb1對缺血性腦損傷有保護(hù)作用，在腦缺血后自由基大量生成時，可作為自由基清除劑發(fā)揮作用[12]。人參皂甙Rb1可通過蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)信號傳遞途徑使突觸磷酸化，從而促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放[13]。人參皂甙Rb1是糖皮質(zhì)激素受體及雄激素受體的配體，作為激動劑可以促進(jìn)離子快速內(nèi)流及一氧化氮生成[14]。人參皂苷還能通過影響身體內(nèi)某些微生物間相互轉(zhuǎn)化，達(dá)到抗炎、抗菌作用[12,15]。

在動物實(shí)驗(yàn)中，人參皂甙可以抑制血小板聚集。人參皂甙可以促進(jìn)血小板cAMP水平升高，降低血栓素A2的生成及釋放，抑制前列環(huán)素生成。人參皂甙干預(yù)8周，可以延遲主動脈粥樣硬化斑塊的形成。人參皂甙Rb1以劑量依賴方式，促進(jìn)綿陽紅細(xì)胞葡萄糖攝?。蝗藚⒃磉癛b2可以通過促進(jìn)糖酵解酶的活性，調(diào)節(jié)胰島素的分泌及糖代謝。人參皂甙Rg1及Rb1可促進(jìn)大鼠大腦皮層神經(jīng)末梢谷氨酸釋放，對學(xué)習(xí)、記憶等認(rèn)知功能有促進(jìn)作用。在動物實(shí)驗(yàn)中，人參皂甙對某些疾病及反應(yīng)具有保護(hù)或抑制作用[16-17]。人參皂甙Rb1對缺血性腦損傷及螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，其作用類似于親神經(jīng)因子[18]，提示人參皂甙可能對帕金森病及阿爾茨海默病等神經(jīng)變性疾病有治療作用[19]。人參皂甙Rd具有免疫佐劑作用，可以通過調(diào)節(jié)Th1及Th2細(xì)胞因子的基因表達(dá)等作用，誘導(dǎo)Th1及Th2細(xì)胞免疫反應(yīng)。在大鼠血管性癡呆模型中，人參皂甙Rg2可通過抗凋亡，保護(hù)記憶功能；可能對血管性癡呆及其他缺血性損傷有治療意義[20]。人參皂甙Rg2還對病毒感染造成的細(xì)胞壞死有保護(hù)作用[21]，通過自噬糾正由于細(xì)胞能量代謝異常導(dǎo)致的脂肪堆積[22]。

本研究顯示，在大鼠脊髓缺血再灌注損傷過程中，人參皂甙Rb1可通過促進(jìn)survivin表達(dá)，抑制凋亡等途徑發(fā)揮保護(hù)作用。在10～40 mg/kg劑量范圍內(nèi)，其保護(hù)作用隨劑量增大而增強(qiáng)。這為人參皂甙Rb1在臨床上的應(yīng)用提供了動物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]夏炳江,肖魯偉.脊髓慢性壓迫減壓后缺血再灌注損傷研究進(jìn)展[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2017,35(4):998-1001.

[2]Rezaian J.Role of apoptosis in CNS emphasizing spinal cord injuries:a commentary[J].Iranian J Neurol,2016,1(4):30-31.

[3]Kumar S.Caspase function in programmed cell death[J].Cell Death Differ,2007,14(1):32-43.

[4]Sokolowska J,Urbanska K.Survivin expression in correlation with apoptotic activity in canine lymphomas[J].Pol J Vet Sci,2017,20(2):329-338.

[5]Zheng Q,Bao XY,Zhu PC,et al.Ginsenoside Rb1 for myocardial ischemia/reperfusion injury:preclinical evidence and possible mechanisms[J].Oxid Med Cell Longev,2017,2017:6313625.

[6]張輝,董建鋒,趙秋振,等.川芎嗪對腦缺血再灌注皮質(zhì)神經(jīng)元生存素表達(dá)的影響[J].中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志,2007,16(6):682-685.

[7]Zumbragel FK,Machtens DA,Curth U,et al.Survivin does not influence the anti-apoptotic action of XIAP on caspase-9[J].Biochem Biophys Res Commun,2017,482(4):530-535.

[8]Ceballoscancino G,Espinosa M,Maldonado V,et al.Regulation of mitochondrial Smac/DIABLO-selective release by survivin[J].Oncogene,2007,26(54):7569-7575.

[9]孫延卿,陳雄生,曹東,等.氫鹽水可抑制脊髓缺血再灌注損傷兔模型運(yùn)動神經(jīng)元的凋亡[J].中國組織工程研究,2014,18(18):2861-2866.

[10]Seo JY,Lee JH,Kim NW,et al.Effect of a fermented ginseng extract,BST204,on the expression of cyclooxygenase-2 in murine macrophages[J].Int Immunopharmacol,2005,5(5):929-936.

[11]Wang W,Rayburn EM,Zhao Y,et al.Experimental therapy of prostate cancer with novel natural product anti-cancer ginsenosides[J].Prostate,2010,68(8):809-819.

[12]Dong X,Zheng L,Lu S,et al.Neuroprotective effects of pretreatment of ginsenoside Rb1 on severe cerebral ischemia-induced injuries in aged mice:involvement of anti-oxidant signaling[J].Geriatr Gerontol Int,2017,17(2):338-345.

[13]Park S,Ahn IS,Kwon DY,et al.Ginsenosides Rb1 and Rg1 suppress triglyceride accumulation in 3T3-L1 adipocytes and enhance beta-cell insulin secretion and viability in Min6 cells via PKA-dependent pathways[J].Biosci Biotechnol Biochem,2008,72(11):2815-2823.

[14]Leung KW,Leung FP,Huang Y,et al.Non-genomic effects of ginsenoside-Re in endothelial cells via glucocorticoid receptor[J].Febs Letters,2007,581(13):2423-2428.

[15]Yu S,Zhou X,Li F,et al.Microbial transformation of ginsenoside Rb1,Re and Rg1 and its contribution to the improved anti-inflammatory activity of ginseng[J].Sci Rep,2017,7(1):138.

[16]Chang Y,Huang WJ,Tien LT,et al.Ginsenosides Rg1 and Rb1 enhance glutamate release through activation of protein kinase A in ratcerebrocorticalnerve terminals(synaptosomes)[J].Eur J Pharmacol,2008,578(1):28-36.

[17]Cui YC,Pan CS,Yan L,et al.Ginsenoside Rb1 protects against ischemia/reperfusion-induced myocardial injury via energy metabolism regulation mediated by RhoA signaling pathway[J].Sci Rep,2017,7:44579.

[18]Fujita K,Hakuba N,Hata R,et al.Ginsenoside Rb1 protects against damage to the spiral ganglion cells after cochlear ischemia[J].Neurosci Lett,2007,415(2):113-117.

[19]Sakanaka M,Zhu P,Zhang B,et al.Intravenous infusion of dihydroginsenoside Rb1 prevents compressive spinal cord injury and ischemic brain damage through upregulation of VEGF and Bcl-XL[J].J Neurotrauma,2007,24(6):1037-1054.

[20]Zhang G,Liu A,Zhou Y,et al.Panax ginseng ginsenoside-Rg2 protects memory impairment via anti-apoptosis in a rat model with vascular dementia[J].J Ethnopharmacol,2008,115(3):441-448.

[21]Yang H,Oh KH,Kim HJ,et al.Ginsenoside-Rb2 and 20(S)-Ginsenoside-Rg3 from Korean Red Ginseng Prevent Rotavirus Infection in Newborn Mice[J].J Microbiol Biotechnol,2018,28(3):391-396.

[22]Huang Q,Wang T,Yang L,et al.Ginsenoside Rb2 alleviates hepatic lipid accumulation by restoring autophagy via induction of Sirt1 and activation of AMPK[J].Int J Mol Sci,2017,18(5):E1063.