葉濤，朱路文，阮野，李宏玉，吳孝軍，陳玉宏，趙一點，田源，唐強

1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江哈爾濱市150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱市150001

腦卒中是中國人的主要死亡原因，也是全球成年人永久性殘疾的最常見原因，其中缺血性腦卒中約占所有病例的80%，治療方案有限[1]。針康法是腦卒中康復的一種新策略[2]，即在頭穴叢刺長留針期間同步進行各種康復訓練，強調“針康同步、動態(tài)治療、整體康復”的治療理念，能顯著改善腦卒中患者運動障礙、平衡障礙、言語障礙及吞咽障礙等，提高日常生活活動能力，總有效率達94.67%，優(yōu)于單一針刺、康復訓練。既往我們從腦缺血后神經(jīng)再生、血管新生、軸突再生、炎癥反應、細胞凋亡等多個方面對針康法的腦保護作用進行探討，為針康法的臨床推廣應用奠定理論基礎[2-9]。

腦缺血再灌注損傷誘導的caspase家族“瀑布式”次序激活，與神經(jīng)細胞的凋亡密切相關。本課題組研究證實，針康法的抗凋亡機制與促進缺血半暗區(qū)X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)表達、抑制caspase-9蛋白活化有關[4]。

在caspase級聯(lián)反應中，caspase-8和caspase-3分別為起始者與執(zhí)行者的核心，是細胞凋亡發(fā)生的關鍵步驟及凋亡信號傳導的共同通路[10-11]；細胞凋亡抑制蛋白1(cellular inhibitor of apoptosis 1,cIAP1)能直接抑制caspase家族成員，調節(jié)細胞凋亡相關傳導通路，具有廣泛的抗凋亡活性[12-13]。

本研究觀察針康法對腦缺血大鼠神經(jīng)功能及cleaved-caspase-8、cleaved-caspase-3和cIAP1表達的影響，探討針康法腦保護作用的相關機理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

SPF級Sprague-Dawley大鼠，雄性，10～12周齡，初始體質量240～260 g，購于遼寧長生生物技術有限公司，合格證號SCXK(遼)2015-0001。

大鼠飼養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥大學藥物安全性評價中心SPF級屏障環(huán)境。人工光照12 h∶12 h明暗交替，室溫(24±1)℃，濕度(65±10)%，噪音＜60 dB，通風良好，自由食水。

實驗前，大鼠適應性跑臺訓練，速度15 m/min，每天15 min，共3 d，篩選愿意跑臺訓練的大鼠90只。

本實驗經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學動物實驗管理委員會批準，實驗大鼠的處置符合2006年科技部發(fā)布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。

隨機數(shù)字表法[4]將90只大鼠分入假手術組、模型組、針刺組、康復組和針康組，每組18只，再分成3d、7 d、14 d三個亞組(n=6)。

造模失敗或實驗中死亡，另選大鼠補充。

1.2 主要儀器和試劑

ZH-PT型動物實驗跑臺：徐州利華電子科技發(fā)展有限公司。R03-1型大鼠轉棒疲勞儀：上海欣軟信息科技有限公司。ELX-800型酶標儀：美國BIOTEK公司。WD-9413B型凝膠成像系統(tǒng)、WD-9405B型水平搖床、DY-CZ-24DN型雙垂直蛋白電泳儀、DYY-7C型電泳儀、DYCZ-40D型轉移槽：北京六一生物科技有限公司。一次性無菌針灸針：北京漢醫(yī)醫(yī)療器械中心。

cleaved-caspase-8、cleaved-caspase-3多克隆抗體：美國CELL SIGNALING TECHNOLOGY公司。cIAP1多克隆抗體：美國SANTA CRUZ公司。PVDF膜：美國MILLIPORE公司。預染蛋白分子量標準：加拿大FERMENTAS公司。TEMED：美國AMRESCO公司。驢抗山羊IgG-HRP：上海碧云天生物技術公司。內參抗體β-actin、羊抗兔IgG-HRP、ECL發(fā)光液：沈陽萬類生物科技有限公司。

1.3 造模及入組

參考前期實驗研究[6]，改良Koizumi線栓法[14]制備大鼠永久性大腦中動脈閉塞腦缺血模型。大鼠術前12 h禁食，不禁水。10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉。于(37±1)℃恒溫手術臺上固定大鼠，頸部術區(qū)備皮、消毒，鈍性剝離皮下組織，暴露右側頸總、頸外、頸內動脈，依序結扎頸總動脈近心端、頸外動脈遠心端，頸總動脈主干下方備活結。微動脈夾阻閉分叉處血流，距分叉處5 mm開一個“V”形口，將3 cm線栓(前端2～3 mm石蠟包埋處理)由此口插入；松開微動脈夾，線栓沿頸內動脈進入，達大腦中動脈分支起始處，固定頸總動脈上的活結。常規(guī)消毒、縫合，白熾燈照射維持肛溫(37±1)℃至蘇醒。

假手術組不插入魚線，其余操作相同。

術后24 h行Longa評分，1～3分大鼠納入實驗。

1.4 干預方法

術后24 h，針刺組予頭穴叢刺治療。定位大鼠百會穴及其左右旁開2 mm處，采用直徑0.25 mm、長25 mm針灸針叢刺，快速捻轉1 min后留針2 h，每天1次。

康復組予循序漸進電動跑臺訓練。坡度0°，速度前3 d 8 m/min，4～7 d 12 m/min，7 d后15 m/min，每次30 min，每天1次。

針康組予頭穴叢刺，在長留針期間，行跑臺訓練。針刺和跑臺方案同針刺組和康復組。

假手術組和模型組術后同等條件抓取，不進行任何治療。

1.5 神經(jīng)功能評定

1.5.1 改良神經(jīng)功能缺損評分(modified Neurological Severity Score,mNSS)[6]

各亞組采用mNSS，從運動、感覺、橫梁平衡與反射缺損和異?；顒铀姆矫嬖u估各組大鼠神經(jīng)功能缺損。0分正常，1～6分輕度損傷，7～12分中度損傷，13～18分重度損傷。由不參與動物實驗的2名研究人員分別進行，取平均值。

1.5.2 轉棒測試

各亞組采用平衡運動轉棒儀測試大鼠運動協(xié)調能力[15-16]。開啟電源，轉輪勻速后，將大鼠置于旋轉的轉輪上，開始加速，在5 min內，將速度從4 r/min加速到40 r/min，如果動物從轉輪上脫落或抓住裝置并連續(xù)旋轉兩次而不嘗試在轉輪上行走，則測試結束，記錄大鼠在轉桿上停留的時間。每天2次，重復測試3次，每次間隔15 min。動物術前3 d開始訓練，術前1 d測試作為基線對照值；計算術后3 d、7 d及14 d測試值與對照值的比值[17-18]。

1.6 Western blotting

神經(jīng)功能評定后，各亞組10%水合氯醛4 ml/kg腹腔注射麻醉后斷頭取腦，冠狀位切取缺血側前囟前后各2 mm腦組織，液氮速凍5 min后轉移至-80℃冰箱備用。取適量樣本，加入蛋白裂解液，制成蛋白勻漿；冰上靜置5 min后，4℃12000 r/min離心10 min，取上清液，BCA法測定蛋白總量。上樣體積20 μl，含蛋白40 μg。

濃縮膠濃度5%，分離膠濃度10%(cIAP1、cleaved-caspase-8)、 13% (cleaved-caspase-3)。SDS-PAGE電泳分離目的蛋白(80 V,2.5 h)，電轉移至PVDF膜上(80 V,1.5 h)。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加 cleaved-caspase-8(1∶ 500)、 cleaved-caspase-3(1∶500)一抗4℃過夜，加入羊抗兔IgG-HRP(1∶5000)二抗，37℃孵育45 min。加入cIAP1(1∶100)一抗4℃過2夜，加入驢抗山羊IgG-HRP(1：5000)二抗，37℃孵育2 h。洗膜后ECL發(fā)光液孵育5 min，顯影后拍攝。內參β-action(1∶1000)檢測過程同目標蛋白。

采用Gel-Pro-Analyzer 4.0分析條帶灰度值，以目標蛋白條帶灰度值/β-action條帶灰度值為該樣本目標蛋白相對表達量，以模型組某一樣本蛋白相對表達量為1，其余樣本均為與其校正后的相對表達量[4]。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0進行統(tǒng)計學處理。數(shù)據(jù)均以(±s)表示。采用單因素方差分析，兩兩比較，方差齊者用LSD-t檢驗，不齊者用Tamhane's T2檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 神經(jīng)功能評定

2.1.1 mNSS

術后各時間點，假手術組mNSS評分均為0；與假手術組比較，模型組mNSS評分升高(P＜0.05)。與模型組比較，各治療組mNSS評分降低(P＜0.05)。術后7 d、14 d，與針刺組、康復組比較，針康組mNSS評分進一步降低(P＜0.05)。見表1。

表1 術后各時間點各組mNSS評分比較

2.1.2 轉棒測試

術后各時間點，與假手術組比較，模型組停留時間縮短(P＜0.05)。與模型組比較，各治療組停留時間均延長(P＜0.05)。術后7 d、14 d，與針刺組、康復組比較，針康組停留時間進一步延長(P＜0.05)。見表2。

表2 術后各時間點各組轉棒測試比較

2.2 Western blotting

術后各時間點，假手術組可見cleaved-caspase-8、cleaved-caspase-3少量表達。與假手術組比較，各時間點模型組cleaved-caspase-8、cleaved-caspase-3表達升高(P＜0.05)；與模型組比較，各治療組各時間點cleaved-caspase-8、cleaved-caspase-3表達降低(P＜0.05)。與針刺組、康復組比較，術后7 d、14 d，針康組cleaved-caspase-8表達進一步降低(P＜0.05)。見圖1～圖2、表3～表4。

術后各時間點，假手術組可見cIAP1蛋白高表達。與假手術組比較，各時間點模型組cIAP1表達降低(P＜0.05)。與模型組比較，各治療組各時間點cIAP1表達升高(P＜0.05)。與針刺組、康復組比較，術后7 d、14 d，針康組cIAP1表達進一步升高(P＜0.05)。見圖3、表5。

表3 術后各時間點各組cleaved-caspase-8蛋白比較

圖1 術后各時間點各組cleaved-caspase-8蛋白表達

表4 術后各時間點各組cleaved-caspase-3蛋白比較

圖2 術后各時間點各組cleaved-caspase-3蛋白表達

表5 術后各時間點各組cIAP1蛋白比較

圖3 術后各時間點各組cIAP1蛋白表達

3 討論

缺血急性期，缺血中心區(qū)由于突發(fā)血液供應中斷，發(fā)生嚴重細胞膜離子泵功能障礙及能量代謝衰竭，引發(fā)神經(jīng)細胞死亡，形成不可逆性腦組織損害；而缺血半暗區(qū)腦組織，由于存在側支循環(huán)或大動脈殘留血流等原因，細胞處于休眠狀態(tài)，具有可逆性。挽救處于休眠狀態(tài)的神經(jīng)細胞，對于受損腦組織的結構重塑、神經(jīng)功能的恢復，具有重要意義。

前期研究證實[4]，針康法能有效抑制腦缺血后神經(jīng)細胞凋亡，改善大鼠神經(jīng)功能缺損，優(yōu)于單一的針刺、康復訓練，機制與其上調腦缺血后缺血半暗區(qū)XIAP蛋白表達，抑制caspase-9活化，降低線粒體途徑介導的細胞凋亡有關。本研究顯示，腦缺血后，大鼠神經(jīng)功能損傷嚴重，存在明顯運動協(xié)調功能障礙；隨著時間延長，大鼠神經(jīng)功能和運動障礙有一定程度改善；針康法在促進神經(jīng)功能改善的同時，也促進大鼠協(xié)調運動功能的恢復，并在一定時期后，優(yōu)于單一針刺和康復訓練，有一定治療優(yōu)勢。

caspase家族在細胞凋亡調控機制網(wǎng)絡中處于中心地位。caspase-8、caspase-9分別為死亡受體途徑、線粒體凋亡途徑的上游“起始者”，而caspase-3為啟動凋亡發(fā)生的最終“執(zhí)行者”。caspase-8在死亡受體介導的凋亡途徑中扮演重要角色[10,19-21]：無論是Fas介導通路，還是腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)凋亡途徑，最終都激活caspase-8，進而活化caspase-3、caspase-6、caspase-7等，激活caspase級聯(lián)反應，導致細胞凋亡。激活的caspase-8能在胞漿中裂解Bcl-2家族成員Bid，裂解產(chǎn)物的羧基端片段tBid轉移到線粒體上，誘導線粒體釋放細胞色素C，啟動caspase-9介導的線粒體凋亡途徑[22]。這說明無論在細胞外途徑還是在細胞內途徑中，caspase-8都是關鍵的調控蛋白，活化的caspase-8連接著死亡受體通路與線粒體通路的Cross-talk。

IAP家族是生物發(fā)育和生長過程中廣泛表達的凋亡抑制因子，其凋亡抑制作用比包括Bcl-2家族在內的其他任何家族都要廣泛。它一方面可直接作用于caspase，通過與其相互作用并抑制其活性，發(fā)揮抗細胞凋亡作用；另一方面又在調控凋亡信號轉導途徑中發(fā)揮關鍵作用[12,23-24]。有文獻報道[25-26]，cIAP1、cIAP2、XIAP可以通過阻斷細胞色素C誘導的caspase-9活化，阻止pro-caspase-3、pro-caspase-6、pro-caspase-7的蛋白水解；這些IAP家族成員不能阻止caspase-8誘導的pro-caspase-3蛋白水解活化，但可通過直接抑制活化的caspase-3，中斷下游凋亡事件。另有報道[27]，TNF信號有誘導核因子-κB(nuclear factor κB,NF-κB)的能力，而NF-κB的過度表達可抑制細胞凋亡發(fā)生。

cIAP1/2的抗凋亡活性與其調節(jié)先天性免疫應答中的NF-κB信號傳導途徑的能力有關[23]，可觸發(fā)K63自我泛素化和受體相互作用蛋白1(receptor interacting protein 1,RIP1)的K11和K63泛素化，導致NF-κB激活和細胞存活[28]；與腫瘤壞死因子受體相關因子(tumor necrosis factor receptor-associated factors,TRAFs)綁定，促使cIAP1/2與TNF受體反應，而與Smac/Diablo的綁定能使Smac與XIAP分離，實現(xiàn)XIAP對caspases家族成員的抑制[13,29-31]。此外，cIAP1還能對含有RING結構域的cIAP2、XIAP和Livin等IAPs家族成員進行調控，使其經(jīng)過泛素-蛋白酶體途徑降解[30]。

本研究顯示，腦缺血后，cleaved-caspase-8、cleaved-caspase-3持續(xù)高表達，cIAP1持續(xù)低表達，提示caspase介導的凋亡途徑在調控腦缺血后細胞凋亡中發(fā)揮重要作用，cIAP1表達缺陷與caspase激活介導的細胞凋亡途徑間存在某種關聯(lián)。針刺、康復及針康治療均可有效抑制caspase-8、caspase-3活化介導的細胞凋亡，解除cIAP1表達抑制，上調cIAP1表達水平，共同抑制caspases介導的細胞凋亡級聯(lián)反應。腦缺血后7 d、14 d，針康法的這種抗凋亡效應優(yōu)于單一針刺、康復訓練。

最近，我們通過免疫熒光雙標檢測發(fā)現(xiàn)，腦缺血后3 d、7 d、14 d，cIAP1在腦缺血后的神經(jīng)元(NeuN標記)、微血管(CD31標記)上均存在共表達，針康法治療可上調cIAP1在神經(jīng)元、微血管的表達量，提示cIAP1是介導針康法發(fā)揮神經(jīng)元保護和血管保護的共同靶點。

綜上所述，針康法可以改善腦缺血大鼠神經(jīng)功能缺損，促進運動協(xié)調能力恢復，優(yōu)于單一針刺、康復訓練；其機制可能與抑制caspase-8、aspase-3蛋白活化，促進cIAP1蛋白表達，從而抑制caspases介導的細胞凋亡級聯(lián)反應有關。

當前，我們尚不能明確腦缺血后cIAP1與caspsae-8、caspase-3存在何種聯(lián)系，cIAP1的缺失是否會反轉針康法的抗凋亡作用。下一步我們將采用慢病毒介導的cIAP1基因沉默技術，進一步探討cIAP1在針康法發(fā)揮腦保護作用中的作用及相關機制，為針康法的臨床應用奠定堅實的基礎。

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