李宏玉，唐強，朱路文，王雪，鄭婷婷，陳玉紅，趙一點，尹俠

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱市150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱市150001

缺血性腦卒中常伴有運動、感覺、認知等一系列功能障礙，嚴重影響患者日常生活能力。隨著中國康復(fù)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，中醫(yī)康復(fù)“治未病”思想對防治缺血性腦卒中發(fā)揮較大作用[1]。缺血前運動訓(xùn)練又稱為運動預(yù)處理，是指在腦缺血前給予大量重復(fù)運動訓(xùn)練，能夠誘導(dǎo)腦缺血耐受，具有神經(jīng)保護作用，符合中醫(yī)治未病的思想，成為當前研究的熱點[2-4]。我們以前的研究證實[5-7]，運動預(yù)處理發(fā)揮腦保護作用與降低炎癥反應(yīng)、抑制谷氨酸興奮性、減少細胞凋亡等有關(guān)。ATP敏感性鉀(ATP-sensitive potassium,KATP)通道的開放可以誘導(dǎo)腦缺血耐受，其中內(nèi)向整流性鉀離子通道6.2(inwardly rectifying potassium channel,Kir6.2)、磺脲類受體1(sulphonylurea receptor,SUR1)發(fā)揮著重要作用[8]。本研究探討運動預(yù)處理的腦保護作用與mito-KATP通道的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠，鼠齡8～10周，體質(zhì)量220～240 g，購于北京維通利華實驗動物有限公司，許可證號SYXK(京)2010007。清潔級飼養(yǎng)，溫度(21±2)℃，濕度(60±5)%，通氣良好，晝夜節(jié)律，自由食水。

采用ZH-PT型電動跑臺(徐州利華電子科技發(fā)展有限公司)篩選出適合跑臺訓(xùn)練的大鼠36只。將36只大鼠采用隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組和運動預(yù)處理組，每組12只。

動物飼養(yǎng)及實驗過程均嚴格遵循實驗動物管理和保護相關(guān)規(guī)定。

1.2 主要儀器與試劑

RM2235型石蠟切片機、HI1220型烤片機：德國LEICA公司。DHG-9030A型電熱鼓風干燥箱：上海索域試驗設(shè)備有限公司。TUNEL染色試劑盒、Kir6.2多克隆抗體、SUR1多克隆抗體：北京中杉金橋生物技術(shù)公司。

1.3 模型制備

模型組和運動預(yù)處理組大鼠10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉。頸部正中偏左位置切口，暴露大鼠左側(cè)頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，結(jié)扎頸外動脈及頸總動脈近心端，頸總動脈主干扎活結(jié)，分叉處用動脈夾夾閉，在距頸總動脈活結(jié)約1.5 mm處剪口，將尼龍單纖絲線(直徑0.24～0.26 mm、長5 cm，頭端過蠟)緩慢經(jīng)頸總動脈主干插入頸內(nèi)動脈，深約(18±0.5)mm時有輕微阻力。120 min后，拔出線栓至頸總動脈主干分叉處實現(xiàn)再灌注，手法要輕柔緩慢。假手術(shù)組同法手術(shù)，線栓插入深度10 mm。

參照Longa評分[9]，于大鼠缺血再灌注2 h后對大鼠進行神經(jīng)功能缺損評分。評分1、2、3分的大鼠納入實驗，剔除的大鼠隨機造模補充。

1.4 運動預(yù)處理方案

參照朱路文等[1]制定的運動預(yù)訓(xùn)練方案，于造模前采用ZH-PT型電動跑臺，速度15 m/min，坡度0°，每天30 min，每周6 d，共3周。

1.5 檢測方法

1.5.1 神經(jīng)功能缺損評分

再灌注2 h、12 h、24 h后，參照Longa評分，由同一名對實驗分組不知情的研究人員對各組大鼠進行評分。

1.5.2 Western blotting

再灌注24 h后，各組取6只大鼠，快速斷頭取腦，切取缺血側(cè)皮質(zhì)組織置-80℃冰箱保存。取腦組織樣品，提取總蛋白40μg，10%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)到PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜后，PVDF膜TBST液搖床上洗滌，封閉液搖床封閉1～2 h。按說明書加Kir6.2一抗(1∶500)、SUR1一抗(1∶500)及羊抗兔IgG-HRP二抗(1∶5000)，凝膠成像系統(tǒng)拍照。采用Bio-Rad圖像分析軟件計算積分光密度，以小鼠抗β-actin抗體 (1∶1000)為內(nèi)參，計算各蛋白與β-actin積分光密度值的比值。

1.5.3 TUNEL染色

再灌注24 h后，各組6只大鼠心內(nèi)灌注，切取缺血側(cè)皮質(zhì)組織，常規(guī)制備石蠟切片，厚5 μm。二甲苯浸洗，置21～37℃蛋白酶K工作液中15～30 min。加TUNEL反應(yīng)混合液，37℃暗濕盒內(nèi)反應(yīng)1 h，PBS漂洗；加POD反應(yīng)液，37℃暗濕盒內(nèi)反應(yīng)30 min，PBS漂洗；加DAB底物15～25℃下反應(yīng)10 min，PBS溶液漂洗；拍照，蘇木素復(fù)染，自來水沖洗，脫水、透明、封片。每張切片40×10鏡下隨機采集5個視野，采用Image Pro Plus 6.0計數(shù)凋亡細胞，取平均值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)以(±s)表示。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布、方差齊，采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能缺損評分

各時間點，假手術(shù)組未出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損，Longa評分為0；模型組和運動預(yù)處理組出現(xiàn)不同程度神經(jīng)功能缺損；再灌注24 h后，與模型組相比，運動預(yù)處理組Longa評分降低(P＜0.05)。見表1。

表1 各組再灌注后不同時間Longa評分比較

2.2 Western blotting

與假手術(shù)組比較，模型組Kir6.2、SUR1蛋白水平上升(P＜0.05)。與模型組比較，運動預(yù)處理組Kir6.2、SUR1蛋白水平下降(P＜0.05)。見表2、圖1。

2.3 TUNEL染色

假手術(shù)組見極少數(shù)TUNEL陽性細胞。與假手術(shù)組比較，模型組TUNEL陽性細胞增多(P＜0.05)。與模型組比較，運動預(yù)處理組TUNEL陽性細胞減少(P＜0.05)。見表3、圖2。

圖1 各組缺血區(qū)皮質(zhì)Kir6.2、SUR1蛋白的表達

表2 各組缺血區(qū)皮質(zhì)Kir6.2、SUR1蛋白表達比較(/β-actin)

表3 各組缺血區(qū)皮質(zhì)TUNEL陽性細胞數(shù)比較

圖2 各組大鼠TUNEL陽性細胞表達(bar=100 μm)

3 討論

目前缺血性腦卒中的治療主要應(yīng)用溶栓、血運重建等方法，缺血腦組織雖然得到血液再灌注，但損傷程度卻進一步加重[10]。

中醫(yī)康復(fù)強調(diào)早期診斷和早期治療，預(yù)防疾病復(fù)發(fā)，減少后遺癥[11]。中醫(yī)“治未病”理論應(yīng)用于腦卒中發(fā)生、發(fā)展的各個環(huán)節(jié)，對降低腦卒中的發(fā)生，促進患者康復(fù)，提高患者生活質(zhì)量，有重要意義[12]。

隨著臨床醫(yī)學(xué)的發(fā)展，缺血前干預(yù)的重要性逐漸被認識。Blauenfeldt等[13]認為，腦缺血前1周的運動訓(xùn)練強度與缺血24 h梗死體積和最終梗死體積減少有關(guān)。常用的缺血前干預(yù)方法有運動訓(xùn)練、電針、高壓氧、艾灸等[14]。運動預(yù)處理發(fā)揮腦保護的作用與降低炎癥反應(yīng)、抑制谷氨酸興奮性、減少細胞凋亡等有關(guān)[15]。本研究選擇電動跑臺模擬運動康復(fù)，可以量化運動時間、速度及強度。缺血前至少2周運動訓(xùn)練有腦保護效應(yīng)，可縮小局灶性腦缺血大鼠腦梗死體積[4]。因此，我們制定3周運動預(yù)處理方案，證實運動預(yù)處理可降低腦缺血再灌注損傷，促進神經(jīng)功能的恢復(fù)，與Wang等[16]的結(jié)果基本一致。

KATP通道是偶聯(lián)細胞的能量代謝和電活動的重要通道，由內(nèi)向整流性鉀離子通道家族與磺脲類受體亞單位組成，在神經(jīng)元缺血缺氧中發(fā)揮保護作用[17-18]。腦組織缺血缺氧時，胞內(nèi)ATP和葡萄糖降低，能量不足，Na+和Ca2+超載，引起細胞不可逆損傷[17]。

Kir6.2、SUR1在神經(jīng)血管單元損傷和修復(fù)中發(fā)揮重要作用，可能通過調(diào)控KATP通道影響神經(jīng)血管單元的興奮性和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放實現(xiàn)[19-20]。本研究顯示，腦缺血再灌注后，大鼠腦組織KATP通道開放，Kir6.2、SUR1蛋白水平上調(diào)。缺血前行運動預(yù)處理后，大鼠腦組織Kir6.2、SUR1蛋白表達下調(diào)。

細胞凋亡是腦缺血再灌注損傷主要形式，是指在一定生理和病理條件下，為維護內(nèi)外環(huán)境穩(wěn)定，機體通過調(diào)控多種基因的表達，使細胞主動死亡[21]。細胞內(nèi)鈣失穩(wěn)態(tài)、氧自由基生成、炎癥反應(yīng)、能量代謝障礙等能導(dǎo)致細胞凋亡[22]。腦缺血再灌注發(fā)生后，線粒體損傷后，細胞色素C被誘導(dǎo)釋放到胞質(zhì)中，打破了ATP與dATP之間的平衡，細胞色素C結(jié)合凋亡蛋白酶激活因子1，激活caspase-9、caspase-3等，導(dǎo)致細胞凋亡，這與KATP通道開放相關(guān)[23]。本研究顯示，缺血前運動訓(xùn)練可改善細胞內(nèi)膜mitoKATP通道的通透性，減少細胞凋亡。

綜上所述，運動預(yù)處理可下調(diào)腦缺血再灌注大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)Kir6.2、SUR1蛋白表達，改善細胞內(nèi)膜mitoKATP通道的通透性，降低缺血側(cè)皮質(zhì)的細胞凋亡。結(jié)合行為學(xué)評價，我們認為，運動預(yù)處理能通過調(diào)節(jié)Kir6.2、SUR1蛋白表達，從而改善腦缺血后神經(jīng)功能損傷。

本研究僅從Kir6.2、SUR1蛋白的角度研究運動預(yù)處理的腦保護作用。下一步我們將圍繞mitoKATP通道介導(dǎo)的信號通路，深入探討其作用機制，為缺血性腦卒中運動預(yù)處理臨床防治方案的制定，提供良好的理論基礎(chǔ)。

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